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Titelaufnahme

Titel
Working towards an animal testing free future : development of a simple ELISA-based test to assess the sensitization potential of substances / Sophie Vazulka
VerfasserVazulka, Sophie
Betreuer / BetreuerinGrillari, Regina ; Kirchnawy, Christian
ErschienenWien, 14.09.2016
UmfangVIII, 84 Blätter : Illustrationen, Diagramme
HochschulschriftUniversität für Bodenkultur Wien, Univ., Masterarbeit, 2016
Anmerkung
Mit deutscher Zusammenfassung
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Allergene Kontaktdermatitis, Hautsensibilisierung, THP-1, CD86, CD54, zell-basierter ELISA
Schlagwörter (EN)Allergic contact dermatitis, skin sensitization, THP-1, CD86, CD54, cell-based ELISA
Schlagwörter (GND)Haut / Immunreaktion / Enzyme-linked immunosorbent assay / Testbatterie
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-23474 Persistent Identifier (URN)
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 Das Werk ist frei verfügbar
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Working towards an animal testing free future [1.9 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Allergische Kontaktdermatitis ist eine Immunreaktion auf Hautkontakt mit Allergenen und eine der häufigsten Hauterkrankungen. Daher ist es besonders wichtig, Allergene zu identifizieren, bevor sie Bestandteil von Kosmetika oder Pharmazeutika werden. Bisher beruhte die Bestimmung sensibilisierender Substanzen auf Tierversuchen wie dem LLNA. Seit der EU-weiten Verordnung zum Verbot der Verwendung von Tierversuchen zur Untersuchung kosmetischer Inhaltsstoffe, hat die Entwicklung alternativer in vitro Tests hohe Priorität. Da Hautsensibilisierung ein komplexer Prozess ist, reicht ein einzelner in vitro Test nicht aus, um verlässliche Vorhersagen zu treffen. Alternativ können mehrere Tests in eine Testbatterie integriert werden, zum Beispiel DPRA, ARE und h-CLAT. Im Rahmen dieser Arbeit wurden alle drei Tests am OFI etabliert. Außerdem wurde ein Zell-basierter ELISA zur alternativen Detektion für den h CLAT entwickelt. Mithilfe des ELISA werden die laut dem Originalprotokoll mit Durchflusszytometrie gemessen Oberflächenmarker CD86 und CD54 detektiert. Da FITC-markierte Antikörper für photometrische Messung ungeeignet sind, wurden anti-CD86 und anti-CD54 mit einem HRP-markierten Sekundärantikörper und TMB Lösung gewählt. Die Waschschritte zur Entfernung ungebundener Antikörper wurden optimiert, sowie die Primärantikörper titriert. CoCl2 und p-Benzochinon wurden als Modellsubstanzen zum Vergleich der h-CLAT/ELISA Ergebnisse mit Literaturdaten herangezogen. Die Konzentrationen der Testsubstanzen wurden anhand von mit EZ4U bestimmten IC50 Werte gewählt. Der ELISA konnte allergene und nicht-allergene Substanzen unterscheiden und stimmte mit den Ergebnissen von Durchflusszytometrie Messung und Literaturdaten überein. Viabilitätsbestimmung war nicht reproduzierbar, vermutlich aufgrund der niedrigen Stabilität der Zelllinie THP-1. Trotz hoher Sensibilität muss die Reproduzierbarkeit optimiert werden. Validierung des Tests sowie die Etablierung der Testbatterie bleiben offen.

Zusammenfassung (Englisch)

Allergic contact dermatitis is a common skin condition and a form of hypersensitivity reaction following skin contact with allergenic substances. Especially contact allergens in cosmetics and pharmaceuticals need to be identified before they become ingredients of products. Until recently predictive allergenicity testing relied completely on animal assays like the LLNA. Since the EU wide ban on animal testing for components of cosmetic ingredients, the development of alternative in vitro assays is becoming more important. Skin sensitization is a complex process, thus a stand-alone assay is not sufficient to obtain reliable predictions of sensitization potential. Rather, in vitro assays should be integrated into a test battery, comprising e.g. DPRA, ARE and h CLAT. Within this thesis all three tests were established at the OFI. Additionally, a cell based ELISA was developed as alternative detection method for h CLAT. FITC-labelled CD86 and CD54 antibodies used in the original protocol were found not suitable for photometrical measurement, therefore purified anti-CD86 and anti-CD54 antibodies with HRP conjugated secondary antibody and TMB substrate solution were chosen. The washing steps needed to remove unbound antibodies as well as primary antibody dilutions were optimized. CoCl2 and p-BQ were used as model substances to compare the assays performance to data from literature as well as experiments using the original protocol. The test substance concentrations were chosen based on their IC50, which were assessed using EZ4U cytotoxicity test. The h CLAT/ELISA results were comparable to those obtained by flow cytometry and from literature. Viability data from varied due to the unstability of the cell line THP-1. The developed assay yielded sufficient sensitivity, while reproducibility needs to be optimized e.g. by standardizing the cultivation parameters. Validation of the assay and the establishment of the test battery remain to be done.