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Titelaufnahme

Titel
Establishing an assay for studying the molecular mechanisms of drug resistance in cancer / submitted by Magdalena Teufl
VerfasserTeufl, Magdalena
Betreuer / BetreuerinTraxlmayr, Michael ; Obinger, Christian
ErschienenVienna, February 2017
Umfang107 Seiten : Illustrationen, Diagramme
HochschulschriftUniversität für Bodenkultur Wien, Univ., Masterarbeit, 2017
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Krebs EGFR Tyrosinkinase-Inhibitor Resistenz T790M Mutation Kombinationstherapie in-vitro Testsystem Vorhersage von Resistenzmutationen mutierte EGFR library HEK293T episomale Replikation Selektion Massensequenzierung
Schlagwörter (EN)cancer EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance T790M mutation non-cross-resistant therapeutics combination therapy in-vitro assay prediction of resistance mutations randomly mutated EGFR library HEK293T episomal replication selection deep sequencing
Schlagwörter (GND)Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor / Mutante / Resistenz
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-23433 Persistent Identifier (URN)
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Establishing an assay for studying the molecular mechanisms of drug resistance in cancer [3.77 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor EGFR gehört zur Familie der Rezeptor-Tyrosinkinasen und ist ein Membranprotein auf Zellen von Wirbeltieren. Das Binden eines Liganden, z.B. EGF, führt zur Aktivierung des Rezeptors. Daraufhin werden zahlreiche Signalwege aktiviert, was letztlich zu Zellwachstum und Resistenz gegen Apoptose führt. Sind diese Signalwege konstitutiv aktiviert, kann dies zu unnatürlichem Zellwachstum und der Entstehung von Krebs führen. In der Klinik werden zur Behandlung von verschiedenen Krebsarten derzeit gezielt EGFR-spezifische Inhibitoren eingesetzt. Dazu zählen anti-EGFR Antikörper als auch Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKI). Die Entstehung von Resistenzen zählt jedoch zu den größten Problemen in der Bekämpfung von Krebs. Daher wird vor allem die Kombinationstherapie mit Medikamenten, welche verschiedene Resistenzmechanismen hervorrufen, als erfolgsversprechend angesehen. Nur wenige Modelle existieren, die das Vorhersagen von Resistenzmechanismen ermöglichen. Im Zuge dieser Arbeit wurde an der Entwicklung eines in-vitro Testsystems gearbeitet, welches eine Erforschung und Voraussage jeder möglichen Resistenzmutation im EGFR Gen innerhalb sehr kurzer Zeit ermöglicht. Eine Library, bestehend aus EGFR Mutanten, wurde mittels error-prone PCR hergestellt und zur Transfektion von HEK293T Zellen verwendet. Die transfizierte Zellpopulation wurde mittels Durchflusszytometrie auf die Phosphorylierung des EGF-Rezeptors untersucht, nachdem ein Selektionsdruck angelegt worden war (z.B. ein TKI). Da das Phosphorylierungssignal intrazellulär detektiert wird, wurden die Zellen davor fixiert und permeabilisiert. Nur die EGFR Mutanten, welche Resistenzmutationen aufwiesen, zeigten in der Anwesenheit des Inhibitors ein Signal und wurden selektiert und zur Isolation der DNA herangezogen. Wird eine Selektion durchgeführt, kann die intakte DNA zur erneuten Transfektion der Zellen verwendet werden und schlussendlich auf Resistenzmutationen untersucht werden.

Zusammenfassung (Englisch)

The epidermal growth factor receptor EGFR is a receptor tyrosine kinase found on the cell surface of vertebrates. Binding of a ligand, like EGF, prompts activation of a variety of signalling pathways, ultimately leading to cellular growth and survival. When the receptor is overexpressed or mutated, aberrant activation of cellular signalling pathways can lead to cancerous cell growth. Currently, anti-EGFR antibodies like cetuximab as well as tyrosine kinase inhibitors (TKIs) are used in order to halt tumor progression. Though, the emergence of resistance presents a major challenge concerning the use of EGFR inhibitors. Therefore, the development of non-cross-resistant combination therapy is crucial in order to stop or at least delay the onset of resistance. Only few models exist, which allow the prediction of resistance mutations. Therefore, this thesis aimed at the development of an in-vitro assay, which allows the prognosis of resistance mutations emerging upon EGFR-targeted therapy in cancer. An EGFR library, which had been randomly mutated using error-prone PCR, was used for the transfection of HEK293T cells. In order to express only one EGFR mutant per cell, the transfection procedure was optimized to yield only one plasmid per cell. The transfected cell population, expressing mutant EGFR on the cell surface, was subjected to a selection pressure (i.e. a TKI) and the resulting intracellular phosphorylation signal exhibited by EGFR was detected via flow cytometry. Access to the cell interior was granted through prior fixation and permeabilization. Only EGFR mutants harbouring resistance mutations showed a phosphorylation signal in the presence of an EGFR inhibitor and hence were selected and used for the isolation of functional DNA. After selection, the intact genomic material will be amplified using PCR and further subjected to a subsequent selection cycle. Ultimately, the DNA shall be analysed and the mutations conferring resistance can be determined.