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Titelaufnahme

Titel
Expression of polyamide-hydrolyzing enzyme / submitted by: Raditya Subagia
VerfasserSubagia, Raditya
GutachterGübitz, Georg ; Biundo, Antonio
ErschienenVienna, September 2016
Umfangviii, 90 Blätter : Illustrationen, Diagramme
HochschulschriftUniversität für Bodenkultur Wien, Univ., Masterarbeit, 2016
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Humicola Insulens Cutinase (HiC), Polyamide, Pa 6.6, Hydrolyse, Wasserstoff-Akzeptoren. Stickstoff Inversion, Periplasmatische Expression
Schlagwörter (EN)Humicola Insulens Cutinase (HiC), Polyamide, Pa 6.6, Hydrolysis, Hydrogen Acceptor. Nitrogen Inversion, Periplasmic Expression
Schlagwörter (GND)Cutinase / Rekombinantes Protein / Bioreaktor
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-22799 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
Dateien
Expression of polyamide-hydrolyzing enzyme [2.65 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Cutinasen katalysieren in der Natur den Abbau von Cutin, dem polyesterartigen Hauptbestandteil der Cuticula von Pflanzen, und werden industriell für die Hydrolyse wichtiger Ester eingesetzt. Cutinasen weisen die gleiche /-Hydrolase-Faltung und die Ser/His/Asp katalytische Triade wie Prolyl oligopeptidasen auf. Durch Einführung von Wasserstoff-Akzeptoren in die Humicola insolens Cutinase (HiC) via Mutation, die die räumliche Anordnung der Wasserstoffbindung mit dem reagierenden Stickstoff des Amidsubstrats nachahmt, wird die voraussetzende Stickstoffinversion für die Hydrolyse von Amidbindungen ermöglicht. Basierend auf der Arbeit von Syrén et al. (2012) wurde die Möglichkeit der weiteren Erhöhung der Amidbindung hydrolysierende Fähigkeit durch das Kombinieren der Mutationen evaluiert. Das Wildtyp HiC Gene, sowie die Singlemutante SM (I167Q) und Doppelmutante DM (L64H - I167Q) wurden in den Vektor pET-26b(+) subkloniert, unter Erhaltung der pelBLeader-Sequenz für eine periplasmatische Expression und der His-Tag Sequenz für eine anschliessende Affinitäts-Reinigung. Die Transformation in den E.coli BL21-Gold-(DE3) erlaubt die Expression des Enzyms via Induktion. Eine frühe Ernte des Enzyms nach achtstündiger Induktion in der Schüttelkultur wurde durchgeführt, um den Produktverlust durch Lyse der Zellen zu verhindern. Jedoch wurde keine hohe Ausbeute an löslichem Protein erzielt. Die Enzymproduktion im Bioreaktor ergab einen moderaten Ertrag an Produkt pro Biomasse von WT, SM und DM wie folgt: 0.83 mg g-1, 1.20 mg g-1, 1.75 mg g-1. Der Wasserkontaktwinkel der mit SM und DM bei 37 C sowie bei 50 C behandelten PA 6.6 Filme zeigte keine Abnahme ihrer Hydrophobizität im Vergleich zu dem WT. Keine signifikante Menge an freigesetztem Hydrolyseprodukt wurde entsprechend durch GC/MS erkannt. Weitere Hydrolyse Versuche bei höheren Temperatur (60 C), die noch unter der Tm von HiC und nah an der Tg von PA 6.6 liegt, sollte das volle Potenzial der mutierten Enzyme erschließen.

Zusammenfassung (Englisch)

Found in nature as plant cuticle-degrading enzymes, cutinases have been described as versatile enzymes, hydrolyzing a wide variety of industrial important esters. Being esterolytic enzyme, cutinases share interestingly the same /-hydrolase fold and the Ser/His/Asp catalytic triad with prolyl oligopeptidases. By introduction of hydrogen acceptor to Humicola insolens cutinase (HiC) upon mutation, mimicking the spatial arrangement of hydrogen bond formed with the reacting nitrogen of the amide substrate, which facilitates the prerequisite nitrogen inversion in amide bond hydrolysis, we explored the possibility of increasing amide bond hydrolyzing capability by combining mutation investigated in the work by Syrén et al. (2012). Genes of the HiC WT, SM (I167Q), DM (L64H - I167Q) were subcloned into pET-26b(+), preserving the pelB leader sequence for periplasmic expression of soluble proteins and His-tag sequence for affinity-based purification method. Transformation into the expression host BL21- Gold(DE3) permitted the expression of enzyme after induction. An early harvest of shaker flask fermentation at the 8th hour was attempted to optimize the yield against product loss into the medium caused by lysis of the cells, yet no significant gain of soluble protein was achieved. Large scale production in bioreactor yielded a moderate amount of product per biomass of the WT, SM, and DM as follows: 0.83 mg g-1, 1.20 mg g-1, 1.75 mg g-1. The water contact angle of treated PA 6.6 film by the SM and DM at 37 C as well as 50 C did not show any decrease of its hydrophobicity compared to the WT, which is supported by the GC/MS result, that there is no significant amount of released hydrolysis product at the corresponding temperature detected. Further hydrolysis investigation at higher temperature (60 C), which still lies below the Tm of HiC and near the Tg of PA 6.6 representing conducive working temperature for hydrolysis, may unlock the full capability of the variant enzymes.