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Titelaufnahme

Titel
Evaluation of microparticle based multiplexed applications for minimal invasive diagnostics / von Anda Kostov
VerfasserKostov, Anda
Betreuer / BetreuerinWeinhäusel, Andreas ; Pulverer, Walter
ErschienenWien, Juni 2016
Umfangxii, 103 Seiten : Illustrationen, Diagramme
HochschulschriftUniversität für Bodenkultur Wien, Univ., Masterarbeit, 2016
Anmerkung
Mit deutscher Zusammenfassung
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Frühdiagnostik Biomarker Multiplex Micropartikel qPCR Hybridisierung Autoantibody
Schlagwörter (GND)DNS / Methylierung / Marker / Dickdarmkrebs
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-21841 Persistent Identifier (URN)
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Evaluation of microparticle based multiplexed applications for minimal invasive diagnostics [3.3 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

DNA-Methylierungs- und Proteinbiomarker eignen sich besonders zur minimal-invasiven Diagnostik. Unter Verwendung von geringen Blut und Serum-Probenmengen ermöglichen diese die Früherkennung von Krankheiten und Implementierung in präsymptomatische Screening Programme. In dieser Arbeit wurde die Eignung der Evalution Plattform von MyCartis zur Multiplex-Detektion von DNA- und Protein-Biomarkern überprüft. Mit einem am AIT identifizierten Set von 48 Kolon-Karzinom spezifischen DNA Methylierungsmarkern wurde die Multiplex-Analyse mittels Micropartikel-basierter Hybridisierung nach PCR-Amplifikation evaluiert. Für diese Marker wurden qPCR-Tests entsprechend den MIQE Richtlinien erfolgreich qualifiziert. Hybridisierungskonditionen wurden mittels synthetischer Oligonukleotide optimiert, und durch Entwicklung eines verbesserten Detektionsprotokolls die Test-Laufzeit auf 1 h reduziert. Weitere Optimierungen unter Verwendung verschiedener Hybridisierungspuffer ermöglichten eine Steigerung der Nachweisempfindlichkeit (LOD<10nM) und Reduktion der Kreuzhybridisierung. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die prinzipielle Eignung der Plattform zur Autoantikörper-basierten Diagnostik getestet. Ein indirekter Immunoassay wurde implementiert, wobei Serum-Auto-Antikörpern durch Bindung an Mikropartikel gekoppelte Protein-Antigene detektiert wurden. Kopplungs- und Detektionsprotokolle wurden erfolgreich getestet und die Eignung der Evalution-Plattform für dieses diagnostische Prinzip bestätigt. Die Multiplex-analyse mit kodierten Mikropartikeln in mikrofluidischen Kanälen mittels der Evalution Plattform ist aufgrund kurzer Analysezeiten, dynamischer Laufparameter Steuerung und der Echtzeitdarstellung der Messsignale eine wertvolle Alternative zu anderen Multiplex- Detektionsmethoden. Auf Basis der durchgeführten Arbeiten ist die Eignung der Plattform besonders für Protein-basierte Tests gegeben, während für DNA basierte Tests eine Verbesserung der aktuellen Version notwendig ist.

Zusammenfassung (Englisch)

DNA-methylation and protein-biomarkers have been recognized as very useful tools for minimal invasive diagnostics. These can be detected in volumes of patient's blood or serum, thus allowing integration into pre-symptomatic screening programs. The aim of this work was to evaluate the suitability of Evalution, a microparticle based multiplexing platform from MyCartis, to investigate protein and DNA methylation based biomarkers. Assays design was based on a set of 48 colon cancer specific biomarkers targeting aberrantly methylated DNA, identified and validated previously by AIT. Aiming multiplexed analyses of DNA-methylation markers upon PCR amplification from patient samples by microparticle based hybridization, PCR assays were qualified according MIQE guidelines. Then hybridization conditions were optimised using synthetic oligonucleotides. After establishment of an optimized detection protocol, the per-experiment run time was reduced to 1 h. Further optimisation using different hybridization buffers enabled improved detection sensitivity (LOD <10nM) and reduced cross-hybridization. The second part of the thesis was a proof of principle study for autoantibody based diagnostics using the Evalution platform. Therefore an indirect immunoassay was setup; therefore auto-antibodies from human serum were bound to the antigenic proteins immobilized on microparticles and detected by a labeled secondary antibody. Coupling and detection protocols were set which demonstrated the suitability of the platform for autoantibody testing. Evalution demonstrated its ability of specific detection with short assay times by means of microfluidic channels operated in the reaction limited regime, dynamic control of assay condition and real-time read-out. In this work we could successfully confirm that this platform is a valuable alternative to other methods used for multiplexed protein detection. For DNA based assay detection the current version of the platform has to be improved.