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Titelaufnahme

Titel
(Semi)-rational engineering of the protein shell around the cyanid ligand coordinated to the proximal iron atom of the H-cluster in chlorophycean [FeFe]-hydrogenases / composed by Hannes Konegger
VerfasserKonegger, Hannes
Betreuer / BetreuerinObinger, Christian ; Winkler, Martin ; Ludwig, Roland
ErschienenWien, November 23, 2016
Umfang98 Blätter : Diagramme
HochschulschriftUniversität für Bodenkultur Wien, Masterarbeit, 2016
Anmerkung
Mit deutscher Zusammenfassung
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)[FeFe]-Hydrogenasen, Protein-Engineering, gerichtete Evolution, Sättigungsmutagenese, Chlamydomonas reinhardtii, Escherichia coli, Eisen-Schwefel-Cluster, Elektronentransfer, recA, recEF,
Schlagwörter (EN)[FeFe]-hydrogenases, protein engineering, directed evolution, site-saturation mutagenesis, Chlamydomonas reinhardtii, Escherichia coli, iron-sulfur-cluster, electron transfer, recA, recEF
Schlagwörter (GND)Hydrogenasen / Methylviologen
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-21192 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
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Dateien
(Semi)-rational engineering of the protein shell around the cyanid ligand coordinated to the proximal iron atom of the H-cluster in chlorophycean [FeFe]-hydrogenases [25.61 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Die elektrochemischen Eigenschaften von [FeFe]-Hydrogenasen werden maßgeblich durch das komplexe Zwischenspiel des zentralen Eisen-Schwefel Cofaktors und dessen näherer Proteinumgebung beeinflusst. In dieser Arbeit wurde der Ansatz einer gerichteten Evolution verfolgt, um die Effekte einer simultanen Randomisierung zweier Proteinpositionen, welche sich in der direkten Umgebung des CN- Liganden des 2[FeS]-Clusters befinden, zu untersuchen. Zunächst musste dafür ein sensitives, anaerobes und semi-quantitatives Screening Assay, begründet auf der enzymbasierten Reduktion von Methylviologen durch die [FeFe]-Hydrogenase CrHydA1, entwickelt werden. Die Implementierung verschiedenster Methoden der Sättigungsmutagenese in E. coli BL21(DE3)iscR zeigte schwerwiegende Probleme bezüglich einer unvorteilhafter Rekombination und Verarbeitung der Bibliothek auf, welche durch eine kleine Modifikation von bereits etablierten Protokollen behoben werden konnten. Das abschließende Screening der Enzym Bibliothek förderte 21 aktive Varianten von CrHydA1 zu Tage, welche anschließend charakterisiert wurden. Dabei konnte die Mutante A94S identifiziert werden, welche im Vergleich zum Wildtyp Enzym überragende katalytische Fähigkeiten aufweist. Die Einführung einer zusätzlichen Wasserstoffbrückenbindung zwischen der Position 94 und dem CN- Liganden trägt dabei vermutlich zu dem gemessenen Anstieg der Oxidations- und Reduktionseffizienz der Variante A94S von jeweils 290% und 130% bei.

Zusammenfassung (Englisch)

The electrochemical properties of [FeFe]-hydrogenases are directly influenced through the complex interplay between the central iron-sulfur cofactor and ist near protein environment. Within this thesis, a directed evolution strategy was followed to investigate the effects confered by the simultaneous randomization of two residues adjacent to the CN- ligand coordinated to the 2[FeS]-subcluster. As a first step, a highly sensitive anaerobic screening assay based on the reduction of methylviologen mediated through the [FeFe]-hydrogenase CrHydA1, could be developed to semi-quantify the catalytic properties of the examined enzyme variants. The implementation of various site-saturation mutagenesis methods in E. coli strain BL21(DE3)iscR revealed several problems related to recombination and the unfavourable processing of the screening library, which were eventually solved via minor adaptation to previously reported protocols.The concluding screening of the enzyme library identified 21 active CrHydA1 variants which were subsequently characterized, whereupon one particular variant, namely A94S, showed superior catalytic properties in comparison to the wild-type protein. The introduction of an additional hydrogen bond between the residue 94 and the CN- ligand might contribute to the pronounced increase in oxidation and reduction efficiency of A94S by 290% and 130%, respectively.