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Titelaufnahme

Titel
Protein synthesis and detection in a wheat germ derived in vitro protein synthesis system / eingereicht von: Marie Kalender
VerfasserKalender, Marie
GutachterSinner, Eva-Kathrin ; Tan, Cherng-Wen Darren
ErschienenWien, 27.12.2016
Umfang61 Seiten : Illustrationen
HochschulschriftUniversität für Bodenkultur Wien, Univ., Masterarbeit, 2016
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)in vitro Proteinexpression iMAPS CD4
Schlagwörter (EN)in vitro protein expression iMAPS CD4
Schlagwörter (GND)Membranproteine / Proteinsynthese / Zellkultur
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-20679 Persistent Identifier (URN)
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Protein synthesis and detection in a wheat germ derived in vitro protein synthesis system [4.72 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Membranproteine erfüllen wichtige Aufgaben wie Kommunikation und Transport in und zwischen einzelnen Zellen. Zellen ohne funktionsfähige Membranproteine können nicht korrekt arbeiten, was zu einer Vielzahl an Krankheitsbildern führen kann. Forschungsarbeit in diesem Bereich ist daher unlässlich für die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden. Die synthetische Produktion von Membranproteinen könnte eine Alternative zur aufwändigen Proteinextraktion aus lebenden Zellen darstellen. In vitro Proteinsynthese beschreibt den Prozess der Proteinexpression ohne lebende Zellen. Das Zufügen von Membranstrukturen zu diesem Prozess führt zur Integration der Proteine in diese Strukturen. Auf diese Weise wird ein Modell der Zellmembran erhalten, das aus einer Membran und darin eingefügten Proteinen besteht. Allerdings ist bis dato unklar, wie dieser Integrationsprozess vonstatten geht. Die Entwicklung reproduzierbarer Protokolle für die in vitro Proteinsynthese und die Proteindetektion stellt daher eine notwendige Grundlage für den Fortschritt auf diesem Gebiet dar. Der erste Schritt hierbei besteht aus der Wahl eines geeigneten eukaryotischen Expressionssystems und eines Expressionsvektors. Für diese Arbeit wurde ein System aus Weizenkeimextrakt gewählt, da es vergleichsweise niedrige Levels kontaminierender messenger RNA enthält. Die Proteindetektion mit Western Blot hat sich in diesem Fall als ungeeignet herausgestellt. Grund hierfür war die unzureichende Spezifität der Antikörper, die mit mehreren Komponenten des Weizenkeimextrakts reagiert haben. Der Einbau fluorophor-markierten Lysins in die in vitro exprimierten Proteine stellte eine alternative Detektionsmethode dar. Mit dieser Methode konnte die Expression und Detektion des Proteins CD4 gezeigt werden, das eine zentrale Rolle in der HIV-Infektion spielt.

Zusammenfassung (Englisch)

Membrane proteins perform important tasks like communication and transport in and between single cells. Cells that lack functional membrane proteins will cease to work properly, resulting in a variety of human diseases. Membrane protein research is thus a necessity for the progress of developing medical treatment. Synthetic production of membrane proteins could replace the demanding task of protein extraction from cells. In vitro protein synthesis describes the process of protein expression without living cells. Supplementing the reaction with membranes leads to integration of the proteins into them, so providing a minimal cell membrane model consisting of a membrane with embedded protein. Yet, it is not clear how this integration process occurs. Establishment of reproducible methods for in vitro protein expression and detection is critical for research in this field. The choice of expression system, among many available, and the design of a suitable expression vector are the first steps towards successful in vitro protein synthesis. From available eukaryotic systems, one derived from wheat germ was chosen due to its comparatively low levels of contaminating messenger RNA. Protein detection with Western blot has proven to be inadequate in this case, as the specificity of most antibodies used is not high enough and multiple reaction components interfered with the desired binding events. The incorporation of fluorophore-labelled lysine into the proteins produced in the in vitro synthesis reaction seems to be a more suitable method. Reproducible expression and detection of the AIDS-related protein CD4 was achieved this way.