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Titelaufnahme

Titel
Protein surface display and virus like particle generation in insect cells / submitted by Daniel Stadlbauer
VerfasserStadlbauer, Daniel
GutachterGrabherr, Reingard ; Wilde, Monika
ErschienenVienna, 05/2016
UmfangIII, 79 Seiten : Illustrationen, Diagramme
HochschulschriftUniversität für Bodenkultur Wien, Univ., Masterarbeit, 2016
Anmerkung
Mit deutscher Zusammenfassung
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Protein Display Virusartige Partikel Screening Influenza VLP Insektenzellen HighFive Sf9 TEM
Schlagwörter (GND)Insekten / Zelllinie / Baculoviren / Expressionsvektor / Membranproteine
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-20645 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
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Protein surface display and virus like particle generation in insect cells [2.62 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Protein Oberflächen-Display in Insektenzellen eröffnet vielfältige Möglichkeiten im Bereich der Generation von Libraries und der Etablierung von Screening Plattformen. Dabei bieten Insektenzellen Vorteile wie eine einfache Handhabung und schnelle Produktion, im Vergleich zu Säugetierzellen, und die Fähigkeit, eukaryotische posttranslationale Modifikationen durchzuführen. In den letzten Jahren ist die Produktion von virusartigen Partikeln (VLPs) bedeutender geworden, wegen der Möglichkeit, diese als Vakzin zu verwenden, welche zu starken Immunantworten führen, und diese als Werkzeug im Bereich der Diagnostik einzusetzen. In dieser Arbeit wurde das Baculovirus Expressionssystem (BEVS) verwendet, um rekombinant verschiedene Modellproteine an der Oberfläche von Insektenzellen zu exprimieren. Die Modellproteine wurden gemeinsam mit dem Influenza Matrixprotein M1 weiters dafür eingesetzt, um die Knospung von VLPs zu erreichen. Das Ziel war es, sowohl die Modellproteine an der Oberfläche der Zellen als auch die Generierung von VLPs nachzuweisen, sowie die Eignung zweier verschiedener Insektenzelllinien dafür zu vergleichen. Zuerst wurden Expressionskonstrukte kloniert und rekombinante Baculoviren daraus erzeugt, um damit die Insektenzelllinien Spodoptera frugiperda Sf9 und Trichopulsia ni BTI-TN5B1-4 “HighFive“ zu infizieren. Darauffolgende SDS-PAGE und Western Blot Analyse zeigten die erfolgreiche Expression dieser Konstrukte. Das Display der gewählten Proteine konnte mittels Durchflusszytometrie erfolgreich bewiesen werden. Eine Ultrazentrifugation in Kombination mit einem diskontinuierlichen Sucrose Gradienten wurde durchgeführt, um Baculoviren von VLPs zu trennen. Danach wurde eine erneute Ultrazentrifugation ausgeführt, um einen hohen Grad an Reinheit zu erreichen, welcher für die anschließende Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) notwendig war. Die erhaltenen Bilder von der TEM zeigten Baculoviren, sowie auch Strukturen von kugelförmigen virusartigen Partikeln.

Zusammenfassung (Englisch)

Protein surface display in insect cells offers manifold possibilities in the fields of library generation and the establishment of screening platforms. Thereby, insect cells provide benefits like easy handling and fast production, compared to mammalian cell lines, and the capability of eukaryotic protein processing. The generation of virus like particles (VLPs) emerged in recent years because of their application as possible vaccines, featuring strong immune responses, and as a tool in the domain of diagnostics. In this study the baculovirus expression vector system (BEVS) was used to recombinantly express different model proteins on surface of insect cells. The same proteins, in combination with the influenza A matrix protein M1, were further applied to induce budding of virus like particles. The aim was to prove, both, the display of proteins and the generation of VLPs, together with a comparison of the suitability of two different insect cell lines. First, expression constructs were cloned and recombinant baculoviruses derived thereof were used for infection of Spodoptera frugiperda Sf9 cells and Trichopulsia ni BTI-TN5B1-4 “HighFive” cells. Subsequently SDS-PAGE and Western Blot analysis assured the successful expression of these constructs. The display of selected proteins could be successfully demonstrated by fluorescent activated cell sorting (FACS) analysis. Ultracentrifugation combined with a discontinuous sucrose gradient was performed in order to separate baculoviruses from VLPs. After pooling of the fractions, in which the model proteins could be found, another round of ultracentrifugation was conducted, enabling a high degree of purity necessary for subsequent transmission electron microscopy (TEM). The images obtained from TEM showed baculoviruses as well as spherical virus like particle structures.