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Titelaufnahme

Titel
Clarification of E. coli homogenates by precipitation / verfasst von Mathias Fink
VerfasserFink, Mathias
Betreuer / BetreuerinHahn, Rainer ; Luchner, Markus
ErschienenWien, 2015
UmfangX, 42 Blätter : Illustrationen, Diagramme
HochschulschriftUniversität für Bodenkultur Wien, Univ., Masterarbeit, 2015
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)E. coli Homogenisation Chromatographie Präzipitation
Schlagwörter (EN)E. coli Homogenization Chromatography Precipitation
Schlagwörter (GND)Escherichia coli / Grün fluoreszierendes Protein / Fermentation / Produktaufarbeitung
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-20417 Persistent Identifier (URN)
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Clarification of E. coli homogenates by precipitation [6.12 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Diese Diplomarbeit befasst sich mit der Aufreinigung von grün fluoreszierendem Protein (GFP) aus dem E. coli Stamm HMS 174(DE3), der das pET11a-GFPmut3.1 Plasmid in seinem Genom trägt. Um das intrazellulär produzierte GFP aus den Zellen freizusetzen wurde Hochdruck Homogenisation verwendet. Im Laufe der Produktreinigung kam es wiederholt zum Auftreten eines Niederschlages, der auch noch nach Zentrifugation und Filtration auftrat. Dieser Niederschlag verursachte schlechte Filtrationsergebnisse und barg die Gefahr Chromatographie Säulen zu beschädigen. Außerdem wurde vermutet, dass der Verdrängungseffekt während der Ionentausch Chromatographie von den Substanzen, die den Niederschlag bildeten, verursacht würde. Es wurde also im Rahmen dieser Arbeit versucht, herauszufinden, worum es sich bei diesen Niederschlag handelte, unter welchen Bedingungen er entstand und ob er gezielt gefällt werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass der Niederschlag zu großem Anteil aus Proteinen besteht und seine Bildung hauptsächlich durch Temperatur beeinflusst wird. Um den Niederschlag gezielt zu fällen wurde Hitze, CaCl2 und Polyethylen Glykol (PEG) verwendet. CaCl2 und PEG führten allerdings zu hohen Produktverlusten und wurden daher als nicht geeignet befunden. Im Falle der Hitzefällung wurden im Hinblick auf Kläreffizienz, Reinigungseffekt und Produktausbeute die besten Ergebnissebei ungeklärtem Homogenat erreicht, welches für 3 Stunden bei 50 C inkubiert und anschließend zentrifugiert wurde. Um das Adsorptionsverhalten zu untersuchen, wurden die Anionentauscher CaptoQ und Q-Sepharose FF verwendet. Der Verdrängungseffekt wurde durch die Hitzeinkubation zwar nicht beseitigt, jedoch konnte er in höhere Konzentrationsbereiche verschoben werden. Weiters wurde untersucht wie die DNA durch die Homogenisations Bedingungen beeinflusst wird. Hierbei konnte gezeigt werden, dass mit steigender Anzahl von Stufen und Passagen, die DNA in kleinere Bruchstücke geteilt wird.

Zusammenfassung (Englisch)

In the course of this thesis downstream processing of green fluorescent protein (GFP) produced in the E. coli strain HMS 174(DE3) with the plasmid pET11a-GFPmut3.1 was investigated in detail. For the release of the intracellular product high pressure homogenization was used. During the purification of GFP it occurred that a precipitate was formed over time in the suspensions, even after centrifugation and filtration. This precipitation event complicated the downstream process as it resulted in bad filtration performance, repetitive filtration steps and the risk of damaging chromatography columns. Furthermore, a massive displacement effect was observable during ion exchange chromatography (IEX) at high feed concentrations, which was thought to be caused by the same compounds inducing precipitation. The precipitate was characterized and determined under which conditions precipitation starts. It was shown that the precipitate consists of a high amount of protein and its formation was mainly influenced by storage temperature. Heat, CaCl2 and poly ethylene glycol (PEG) were used as precipitating agents. As both CaCl2 and PEG resulted in relatively high product losses, those are not capable as purification step after homogenization. For heat precipitation it was shown that the best results regarding clearance efficiency, purification effect and product yield were reached when the unclarified homogenate was treated for 3 hours at 50 C and clarified by centrifugation afterwards. The adsorption performance was investigated with the anion exchange resins CaptoQ and Q-Sepharose FF. After heat treatment the displacement effect was still observable although much less effective and occurred mainly at higher feed and thus protein concentrations. Furthermore, it was investigated how host DNA was influenced by homogenization conditions and it was shown that increasing number of stages and passages of homogenization resulted in smaller DNA fragments.