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Titelaufnahme

Titel
Expression, purification and functional characterization of a heme-thiolate peroxygenase of Aspergillus niger / submitted by Susanne Dachs
VerfasserDachs, Susanne
Betreuer / BetreuerinFurtmüller, Paul
ErschienenVienna, February 2016
Umfang87 Blätter : Diagramme
HochschulschriftUniversität für Bodenkultur Wien, Univ., Masterarbeit, 2016
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Hämthiolat-Peroxygenase, Peroxidase, Peroxygenase, Aspergillus niger
Schlagwörter (EN)heme-thiolate peroxygenase, peroxidase, peroxygenase, Aspergillus niger
Schlagwörter (GND)Aspergillus niger / Häm / Peroxidase / Pichia pastoris
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-20325 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
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Expression, purification and functional characterization of a heme-thiolate peroxygenase of Aspergillus niger [2.84 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Bislang sind vier Häm-Peroxidase Superfamilien bekannt. Diese Enzyme verwenden Häm als Redox-Cofaktor für die Katalyse von Wasserstoffperoxid-mediierten Ein- und Zwei-Elektronen-Oxidationsreaktionen von Substratmolekülen wie aromatischen Molekülen, Kationen, Anionen oder sogar Proteinen. Eine von diesen Superfamilien wird Peroxidase-Peroxygenase Superfamilie genannt. Im Gegensatz zu den anderen drei Superfamilien ist sie kaum untersucht. Etwa eintausend mutmaßliche Peroxidase-Peroxygenase Sequenzen aus Pilzen findet man in genetischen Datenbanken, was auf ein weit verbreitetes Vorkommen dieser Enzyme hindeutet. Peroxidase-Peroxygenasen verwenden Wasserstoffperoxid, um Sauerstoff in organische Moleküle einzubauen. Dieser Prozess wird Oxyfunktionalisierung genannt und ist einzigartig unter Enzymen. In dieser Arbeit wurde die Hämthiolat-Peroxygenase aus Aspergillus niger (AnHTP) in Pichia pastoris exprimiert. Das Protein wurde mit einer breiten Auswahl an biochemischen und biophysikalischen Methoden charakterisiert. Nach einer Ammoniumsulfat-Fällung und einer Metallchelat-Affinitätschromatografie wurde das stark glykosylierte monomere Enzym mit einer Ausbeute von 2,8 mg/L homogen gereinigt. Mit unterschiedlichen Substraten zeigt das redoxaktive Enzym sowohl Peroxidase- als auch Peroxygenase-Aktivität. Die Temperaturstabilität wurde mittels Zirculardichroismus und dynamischer Differenzkalorimetrie gemessen. Beide Methoden zeigten einen fast identischen Entfaltungsprozess mit einem einzigen Entfaltungs-Übergang. Compound I-Bildung wurde mit Stopped-Flow Spektroskopie unter Verwendung des Substrates meta-Chlorperbenzoesäure (CPBA) analysiert. Die Ergebnisse wurden in Bezug auf die gut charakterisierte Chloroperoxidase aus Caldaryomyces fumago und der unspezifischen Peroxygenase aus Agrocybe aegerita diskutiert.

Zusammenfassung (Englisch)

There are four heme peroxidase superfamilies known to date. These enzymes use heme as redox cofactor to catalyze the hydrogen peroxide mediated one- and two-electron oxidation of substrate molecules such as aromatic molecules, cations, anions or even proteins. One of them is called the peroxidaseperoxygenase superfamily. In contrast to the other three superfamilies it is rarely investigated. Approximately one thousand putative fungal peroxidase-peroxygenase sequences can be found in genetic databases indicating a widespread occurrence of this enzyme. Peroxidase-peroxygenase uses hydrogen peroxide to introduce oxygen into organic molecules. This process is called oxyfunctionalyzation and it is unique among these enzymes. In this thesis, the heme-thiolate peroxygenase from Aspergillus niger (AnHTP) was expressed in Pichia pastoris. The protein was characterized by a wide range of biochemical and biophysical methods. After ammonium sulfate precipitation and metal chelate affinity chromatography the highly glycosylated monomeric enzyme was purified to homogeneity with a yield of 2.8 mg/L. Using several substrates, the redox active enzyme shows both peroxidase and peroxygenase activity. Temperature stability was measured using circular dichroism and differential scanning calorimetry. Both methods showed an almost identical unfolding process with a single unfolding event. Compound I formation was analyzed with stopped-flow spectroscopy using the substrate meta-chloroperoxybenzoic acid (CPBA). Results were discussed in relation to the well characterized chloroperoxidase from Caldariomyces fumago and unspecific peroxygenase from Agrocybe aegerita.