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Titelaufnahme

Titel
Expression and characterization of carbohydrate oxidizing enzymes / Regina Paukner
Weitere Titel
Expression und Charakterisierung von Kohlenhydrat-oxidierenden Enzymen
VerfasserPaukner, Regina
Begutachter / BegutachterinGrabherr, Reingard ; Furtmüller, Paul Georg
GutachterLeitner, Christian
Erschienen2015
UmfangXI, 112 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2015
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Galaktose Oxidase / heterologe Expression / Thioether Bindung / Massenspektrometrie / steady-state Kinetik / alternative Elektronakzeptoren / E. coli / P. pastoris / Fusarium
Schlagwörter (EN)galactose oxidase / heterologous expression / thioether bond / mass spectrometry / steady-state kinetics / alternative electron acceptors / E. coli / P. pastoris / Fusarium
Schlagwörter (GND)Galactose-Oxidase
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-19957 Persistent Identifier (URN)
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Expression and characterization of carbohydrate oxidizing enzymes [4.67 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Galaktose Oxidase (GalOx) ist ein sekretorisches, von Pilzen produziertes Enzym mit einem breiten Substratspektrum. Das Enzym katalysiert die Oxidation von primären Alkoholen an der C6-Position zu den entsprechenden Aldehyden unter der Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid. Die dafür notwendige zwei-Elektronen Redox-Chemie wird mit Hilfe eines mononuklearen Kupfer-Ions im aktiven Zentrum und einem Tyrosin-Radikal, welches als zweiter Redox-Cofaktor fungiert, bewerkstelligt. Das Kupfer wird von vier Aminosäure-Seitenketten koordiniert: zwei Tyrosinen (Tyr272 und Tyr495) und zwei Histidinen (His496 und His581). Der Kupferligand Tyr272 ist außerdem über sein C- Atom kovalent mit dem Schwefel-Atom von Cys228 unter Bildung einer Thioether-Bindung verknüpft. Die für Galaktose Oxidase kodierenden Gene von Fusarium oxysporum und Fusarium sambucinum wurden erfolgreich heterolog in Escherichia coli und jenes von F. oxysporum auch in Pichia pastoris exprimiert. Die produzierten Enzyme wurden mittels IMAC und einer Gelpermeationschromatographie gereinigt. Anschließend wurden die beiden Galaktose Oxidasen biochemisch charakterisiert. Der Einfluss des pH-Wertes und der Temperatur (Temperaturoptimum, Thermostabilität, dynamische Differenzkalorimetrie) auf die Enzymaktivität wurde untersucht. Für verschiedene Elektronen-Donoren, wie z.B. D-Galaktose, 1-Methyl--D-Galaktopyranosid und D-Melibiose wurden steady-state kinetische Konstanten gemessen. GalOx weist eine hohe Spezifität gegenüber molekularem Sauerstoff als Elektronen-Akzeptor auf. Es konnten keine alternativen Elektronen-Akzeptor gefunden werden. Der Effekt von verschiedenen Komponenten, wie z.B. monovalenten und divalenten Kationen, nicht-ionischen Detergenzien, EDTA, Azid und Cyanid, auf die Aktivität von GalOx wurde untersucht. Die korrekte Bildung der einzigartigen Thioether Bindung konnte mittels Massenspektrometrie für beide Expressionssysteme bestätigt werden.

Zusammenfassung (Englisch)

Galactose oxidase (GalOx) is a secretory fungal enzyme with a broad substrate spectrum. The enzyme catalyzes the oxidation of primary alcohols at the C6-position to the corresponding aldehydes with concomitant reduction of molecular oxygen to hydrogen peroxide. Therefore, a two-electron redox chemistry is provided by a mononuclear copper ion active site and a tyrosine radical serving as the second redox cofactor. The copper is coordinated by four amino acid side chains: two tyrosines (Tyr272 and Tyr495) and two histidines (His496 and His581). Furthermore, Tyr272 is covalently linked at C to the sulphur atom of Cys228 under formation of a thioether bond. The genes encoding for GalOx from Fusarium oxysporum and F. sambucinum were successfully heterologously expressed both in Escherichia coli, and the F. oxysporum gene in Pichia pastoris as well. The corresponding enzymes were purified based on the His-tag, which is provided by the expression vectors, by IMAC followed by a polishing step of size-exclusion chromatography. Furthermore, the biochemical properties of the two galactose oxidases produced by E. coli were investigated. Amongst others, the pH optima and the effect of temperature (temperature optimum, thermal stability, differential scanning calorimetry) on GalOx activity were determined. Steady-state kinetic constants were measured for different electron donor substrates including D-galactose, 1-methyl--D-galactopyranoside and D-melibiose. GalOx is highly specific for molecular oxygen as an electron acceptor and no alternative acceptor could be found. The effect of various compounds (e. g. monovalent and divalent cations, nonionic detergents, EDTA, azide and cyanide) on GalOx activity was determined. The formation of the unique thioether bond in both expression systems was confirmed directly for the first time using mass spectrometry.