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Titelaufnahme

Titel
Development and establishment of platforms for the production and crystallization of recalcitrant proteins and protein complexes / Verfasser: Georg Mlynek
Weitere Titel
Entwicklung und Etablierung von Platformen für die Herstellung und Kristallisation von Proteinen und Protein Komplexen
VerfasserMlynek, Georg
Begutachter / BegutachterinOostenbrink, Chris ; Gruber, Karl
Betreuer / BetreuerinHaltrich, Dietmar
ErschienenWien, 2016
Umfang282 Seiten : Illustrationen, Diagramme
HochschulschriftUniversität für Bodenkultur Wien, Dissertation, 2016
Anmerkung
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Zusammenfassung in deutscher Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Protein Aufreinigung / Röntgenkristallographie / Hochdurchsatz / Methoden / Kristall / Reinheit / Kristallstrukturanalyse / Hochdurchsatz-Screening / Wirkstoffdesign
Schlagwörter (EN)Highthroughput screening / Crystallization screen / Crystal structure / Diffracting crystals / Customize approach / Crystallization strategy / Tailor made crystallization screen / Structure-based drug design
Schlagwörter (GND)Proteine / Kristallisation / Genexpression / Aufreinigung
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-19927 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
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Development and establishment of platforms for the production and crystallization of recalcitrant proteins and protein complexes [52.43 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Proteine sind Makromoleküle, die für alle wichtigen Abläufe in einer Zelle verantwortlich sind. Um die Funktion von Proteinen vollständig zu verstehen, ist es essentiell die Analyse der dreidimensionalen Proteinstruktur mit funktionellen, biochemischen Studien zu kombinieren. Da viele Proteine eine entscheidende Rolle in der Entstehung von Krankheiten spielen, trägt die Aufklärung der Proteinstruktur auf atomarer Ebene nicht nur zum verbesserten Verständnis der zellulären Funktionen bei, sondern ermöglicht auch Aussagen über pathologische Mechanismen zu treffen. Daher ist ein Verständnis der Proteinstruktur auch für die Entwicklung von Arzneistoffen notwendig. Rekombinante Techniken werden üblicherweise zur Herstellung von Proteinproben verwendet, die in wissenschaftlichen Experimenten in Biologie und Biomedinzin sowie in der Biotechnologie zur Anwendung kommen. Die großen Engpässe in der Vorbereitung von Proteinen und ihren Komplexen für funktionelle und strukturelle Studien sind: * Benötigte Mengen im Milligramm-Bereich von aktivem, chemisch und konformativ reinem Protein * Herstellung von Kristallen in Diffraktionsqualität Ziel dieser PhD thesis war eine Plattform zu entwickeln, implementieren und testen, welche die oben genannten Engpässe reduziert. Zuerst wurde eine Hochdurchsatz Protein Expressions- und Aufreinigungsplattform etabliert. Mehrer Qualitätskontrollpunkte wurden eingebaut um die Qualität der Proteine testen zu können. Sollte das Standard Prozedere nicht erfolgreich sein, stehen etliche Rettungsketten zur Verfügung. Es wurde auch darauf wertgelegt, dass die jeweiligen Schritte automatisierbar sind. Die Plattform wurde 2014 publiziert und damit bis heute mehr als hundert Proteine produziert. Im nächsten Schritt wurde eine Plattform zur maßgeschneiderten Kristallization von Proteinen entwickelt und etabliert. Hierbei werden nur jene Chemikalien im Kristallisationsscreens verwendet welche die Stabilität des Proteins erhöhen. Das screening hierfür erfolgt mit biophysikalischen Methoden. In einem standardisierten Vergleichsexperiment konnten wir zeigen, dass unsere Strategie erfolgreicher ist, als die bisher verwendeten Ansätze. Die beiden etablierten Plattformen trugen und tragen zur Optimierung unserer Laborabläufe bei und ermöglichten schon Publikationen in peer reviewed Journals.

Zusammenfassung (Englisch)

Proteins are macromolecules and responsible for a majority of important cellular functions. To understand how proteins carry out diverse processes, it is essential to combine functional studies with an investigation of their three-dimensional structure. Many proteins play critical roles in the development of diseases. An understanding of the protein structure at an atomic level provides not only increased knowledge of cellular functions but can lead to further understanding of pathological mechanisms and thus be critical for the development of therapeutic drugs. Additionally, more and more proteins (e.g. enzymes) are used in daily life, for example in wastewater-treatment or food production. To make enzymes more efficient, nowadays structural biology is used as a major tool. Functional and structural studies of proteins and their complexes requires milligram amounts of active, chemically and conformationally pure protein. The production of proteins for these studies is nowadays mainly performed by recombinant molecular biology techniques. However, every protein has different unique properties leading to unpredictable conditions for optimal protein expression and purification. Therefore the production of proteins poses the first bottleneck in structural studies. The second bottleneck is the generation of diffraction quality crystals employing macromolecular crystallography. To tackle the first bottleneck we established a platform for the production of soluble and stable proteins and/or protein complexes based on parallel screening of nested constructs in E. coli. Efficiency in parallel screening can just be achieved by parallel cloning, and subsequent small scale expression screening in plate format. Once soluble constructs are identified and expressed in large scale, automatized purification is performed. We control the quality of the purified proteins employing several biophysical methods. To tackle the second bottleneck, we developed and established a customized crystallization screening based on the biophysical properties of individual protein targets. The efficiency of our protein production and crystallization platform was assessed and subsequently used on various proteins belonging to the cytoskeleton and various enzyme families. The two established platforms (protein-production and crystallization) are modular and work in tandem, but can also be used as a single entity. The establishment of the two platforms increased the through- and output of our lab, leading to several crystal structures and publications in peer-reviewed journals.