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Titelaufnahme

Titel
Development of a model organism for bacterial surface layer protein O-glycosylation / by Kristof Zarschler
VerfasserZarschler, Kristof
Begutachter / BegutachterinMessner, Paul ; Strauss, Joseph
GutachterMessner, Paul
Erschienen2009
Umfang[Ca. 201] Bl. : Ill.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2009
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Protein Glykosylierung / S-Schicht / Gencluster / Gen Knock-out / Zelloberflächenpräsentation
Schlagwörter (EN)protein glycosylation / S-layer / gene cluster / gene knockout / surface display
Schlagwörter (GND)Paenibacillus alvei / S-Layer / Proteinsynthese / Glykosylierung / Neo-Glykoproteine
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-19436 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
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Development of a model organism for bacterial surface layer protein O-glycosylation [6.08 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Posttranslationale Glykosylierung ist die häufigste und facettenreichste Modifikation von Proteinen. Glykosylierte S- Schichtproteine zählen zu den am besten untersuchten prokaryotischen Glykoproteinen. Die meisten S-Schicht(glyko)proteine besitzen die einzigartige Eigenschaft, durch Selbstorganisation zweidimensionale, kristalline Gitter auf der darunter liegenden Zellwandschicht auszubilden. Paenibacillus alvei CCM 2051T besitzt ein glykosyliertes S-Schichtprotein mit bekannter Glykanstruktur. Die O-Glykankette ist ein Heteropolymer, das an bestimmte Tyrosinreste des S-Schichtproteins SpaA kovalent gebunden ist. Um Einblicke in die Mechanismen der S-Schichtglykan Biosynthese zu erhalten, wurde ein 24,3-kb S-Schichtglykan Biosynthesecluster (slg-Biosynthesecluster) identifiziert, vollständig sequenziert und die Funktion der einzelnen offenen Leserahmen (ORFs) im Datenbankvergleich analysiert. Zur detaillierten Aufklärung der konkreten Funktion jedes einzelnen, im slg-Biosynthesecluster kodierten Enzyms, wurde neben einem zuverlässigen Protokoll für die Transformation von Plasmid-DNS durch Elektroporation und einem Vektor für die heterologe Genexpression ein leistungsfähiges Knock-out System für die gezielte Inaktivierung von Genen entwickelt. Bis auf diejenigen ORFs, die für Enzyme zur Biosynthese von Nukleotid-aktivierten Monosacchariden und für das Membranprotein eines ABC-Transporters kodieren, wurden alle ORFs des slg-Biosynthesecluster durch die Insertion von Ll.LtrB zerstört und die generierten Mutanten mittels Massenspektrometrie analysiert. Zusammen mit den Ergebnissen des Datenbankvergleichs der entsprechenden Proteine erlauben diese Resultate eine nahezu vollständige Zuordnung der jeweiligen biologischen Funktion der Proteine im slg-Cluster. Neben dem slg-Biosynthesecluster wurde das Strukturgen spaA sequenziert und für die Präsentation von chimären S-Schichtglykoproteinen an der Zelloberfläche verwendet. Diese Resultate zeigen deutlich die Möglichkeit, die „Glyko-Dimension“ des S-Schicht-basierenden molekularen Baukastens für Anwendungen in den Biowissenschaften zu manipulieren.

Zusammenfassung (Englisch)

Posttranslational glycosylation is the most prevalent and most diverse modification of proteins. Surface (S-) layer glycoproteins are among the best-studied prokaryotic glycoproteins. Most S-layer (glyco)proteins have the unique feature to self-assemble into two-dimensional crystalline arrays on the supporting cell envelope. Paenibacillus alvei CCM 2051T possesses a glycosylated S-layer with known glycan structure. Its O-glycan is a heteropolymer, which is linked to specific tyrosine residues of the S-layer protein SpaA. To gain insights into the mechanisms governing S-layer glycan biosynthesis, a 24.3-kb gene cluster responsible for glycan biosynthesis (slg gene cluster) has been identified, sequenced, and the genes have been assigned by protein database comparison. To investigate in detail the function of individual enzymes encoded by the slg gene cluster, a reliable protocol for introduction of plasmid-DNA into P. alvei CCM 2051T by electroporation, a shuttle vector for heterologous gene expression, and an effective gene knockout system for insertional inactivation of desired target genes were developed. All ORFs of the gene cluster except those encoding nucleotide sugar biosynthesis enzymes and the ABC transporter integral transmembrane protein were disrupted by insertion of the mobile group II intron, and glycosylated S-layer proteins produced in mutant backgrounds were analyzed by mass spectrometry. These results, combined with the observed similarity of the respective proteins to database entries, allowed an almost complete assignment of their biological function. Additionally, the S-layer structural gene spaA has been sequenced and used for surface display of chimeric S-layer glycoproteins. These data clearly demonstrate the feasibility of manipulating the glyco-dimension of an S-layer based construction kit for life- and non-life science application.