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Titelaufnahme

Titel
Probing the active site of pyranose dehydrogenase by experimental and computational means / Michael Graf
VerfasserGraf, Michael
Begutachter / BegutachterinMacheroux, Peter ; Zagrovich, Bojan
Betreuer / BetreuerinHaltrich, Dietmar
Erschienen2014
UmfangX, 147 S. : graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Agaricus meleagris Pyranose Dehydrogenase / Biochemie / Kohlenhydrate / Enzymkinetik / Fermentation / Flavoprotein / freie Energie / Molekulardynamik Simulationen / Protein Engineering / Reaktionsmechanismus
Schlagwörter (EN)Agaricus meleagris pyranose dehydrogenase / biochemistry / carbohydrates / enzyme kinetics / fermentation / flavoprotein / free energy calculation / molecular dynamics simulations / protein engineering / reaction mechanism
Schlagwörter (GND)Perlhuhnegerling / Pyranosedehydrogenase / Biochemische Analyse
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-19370 Persistent Identifier (URN)
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Probing the active site of pyranose dehydrogenase by experimental and computational means [6.11 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Die GMC Oxidoreduktase Pyranose Dehydrogenase von Agaricus meleagris (AmPDH) beinhaltet einen monokovalent gebunden FAD Cofaktor. AmPDH (di)oxidiert viele verschiedene Zucker an Position C1C4 und ist vermutlich im Ligninabbau involviert. Das Enzym reagiert nicht mit Sauerstoff, dafür aber mit Chinonen und organometallischen Verbindungen. Die StrukturFunktions Beziehungen der Aminosäuren im aktiven Zentrum von AmPDH wurden bisher noch nicht eingehend untersucht. Dadurch sind gezielte Veränderungen, um das Enzym für Zucker-Derivatisierungen, organische Synthesen und in der Bioelektrochemie zu verwenden, schwierig. Im Zuge dieser Dissertation wurden die kovalente Bindung zum FAD und die unmittelbare Umgebung des Isoalloxazins im aktiven Zentrum von AmPDH untersucht. Wildtyp AmPDH und Mutanten des aktiven Zentrums wurden heterolog in der Hefe Pichia pastoris exprimiert und anschließend gereinigt. Danach wurden die Enzyme biochemisch, biophysikalisch und computergestützt charakterisiert. Die experimentellen Methoden umfassten unter anderem ECD, TCA/Aceton Präzipitation, GC-MS der Reaktionsprodukte sowie die Bestimmung der Sauerstoffreaktivität und des Redoxpotentials. Die Steady-State und Pre-Steady-State Kinetik wurden mittels UV-Vis beziehungsweise Stopped-Flow-Spektroskopie bestimmt. Molekulardynamik (MD) Simulationen und Berechnungen der freien Energie konnten experimentelle Ergebnisse untermauern oder anregen.

Zusammenfassung (Englisch)

Pyranose dehydrogenase from Agaricus meleagris (AmPDH), a member of the structural family of GMC oxidoreductases, carries a monocovalently linked FAD cofactor. AmPDH (di)oxidizes many different sugars at C1C4 and is potentially involved in lignin degradation. It is inactive with dioxygen but uses quinones and organometallic compounds instead in its oxidative half-reaction. Functional assignments of active site residues in the enzyme are still elusive to date, making rational protein engineering approaches towards applications in sugar conversions, organic synthesis, and bioelectrochemistry difficult. In the course of this thesis, the monocovalent FAD-linkage and the vicinity of the isoalloxazine in the active site of AmPDH were investigated. Wild type AmPDH and active site variants were heterologously expressed in the yeast Pichia pastoris, purified, and characterized by biochemical, biophysical, and computational means. Experimental techniques included amongst others ECD, TCA/acetone precipitation, GC-MS of reaction products, as well as measuring the oxygen reactivity and redox potential. UV-Vis and stopped-flow spectroscopy were utilized to elucidate steady-state and pre-steady-state kinetics, respectively. Molecular dynamics (MD) simulations and free energy calculations rationalized or suggested experiments.