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Titelaufnahme

Titel
The impact of amino acid metabolism on recombinant protein production in Pichia pastoris / eingereicht von Hannes Rußmayer
VerfasserRußmayer, Hannes
Begutachter / BegutachterinGrabherr, Reingard ; Ferrer, Pau
Betreuer / BetreuerinMattanovich, Diethard
ErschienenSeptember 2015
Umfang122 Blätter, 38 verschieden gezählte Seiten : Diagramme
HochschulschriftUniversität für Bodenkultur Wien, Univ., Dissertation, 2015
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Rekombinante Proteinproduktion / Metabolomics / Fluxomics / Pichia pastoris / Aminosäurebiosynthese
Schlagwörter (EN)Recombinant protein production / Metabolomics / Fluxomics / Pichia pastoris / Amino Acid Metabolism
Schlagwörter (GND)Pichia pastoris / Rekombinantes Protein / Kohlenstoffkreislauf
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-19040 Persistent Identifier (URN)
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The impact of amino acid metabolism on recombinant protein production in Pichia pastoris [6.19 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die methylotrophe Hefe Pichia pastoris (syn. Komagataella sp.) ist ein häufig verwendeter Wirtsorganismus für die Produktion von rekombinanten Proteinen. Einhergehend mit der erfolgreichen Expression einiger Proteine konnte aber auch eine Limitierung in der Synthesekapazität insbesondere für komplexe Proteine (z.B. Antikörper) festgestellt werden. Ist dieses Syntheselimit erreicht oder auch überschritten, kommt es oftmals zu einer extremen Stresssituation für die Zelle. Meist werden solch Situationen durch Limitierungen in spezifischen zellulären Prozessen verursacht. In Hefen wird die Ursache oft einer begrenzten Kapazität in der Proteinfaltung und Sekretion zugeschrieben. Auch Limitierung in metabolischen Prozessen kann nicht ausgeschlossen werden. Spricht man von Limitierung innerhalb des Metabolismus handelt es sich meist um eine Limitierung in der Aminosäurenbiosynthese oder eine Limitierung im Energiemetabolismus der Zelle. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es nun, den Zusammenhang zwischen dem zentralen Kohlenstoffmetabolismus und der rekombinanten Protein-Produktion zu analysieren. Hiefür wurden Metabolome und Fluxome des zentralen Kohlenstoffzyklus von verschiedenen P. pastoris Produktionsstämmen analysiert. Es zeigte sich, dass intrazelluläre Aminosäurepools durch die Produktion eines rekombinanten Proteins beeinflusst werden. Um zu verstehen, ob eine Limitierung in der Synthesekapazität für manche Aminosäuren die rekombinante Proteinproduktion einschränkt, wurden verschiedene Ansätze verfolgt. In einem ersten Experiment wurden Aminosäuren zum Kultivierungsmedium hinzugefügt. Durch die Zugabe der Aminosäuren konnte die Produktion eines Antikörperfragments verbessert werden. Der zweite Ansatz beschäftigte sich mit der Erhöhung intrazellulärer Aminosäurekonzentrationen durch Überexpression von Genen involviert in die Aminosäurebiosynthese. Die Überexpression von 9 aus 14 ausgewählten Genen führte zu einer Steigerung der Produktion einer Carboxylesterase.

Zusammenfassung (Englisch)

The methylotrophic yeast Pichia pastoris (syn. Komagataella sp.) is a well-established host for recombinant protein production. The outstanding efficiency in recombinant protein production in terms of high product titers was already shown several times. The production of recombinant proteins at a high level causes additional stress for the cell. The additional cellular stress decreases cellular fitness, which in the end decreases the productivity of the protein of interest. Such stress situations are caused by limitation within specific cellular processes. In yeast expression systems the major bottlenecks for recombinant protein production are attributed to protein folding and secretion. However, limitations within metabolism could constitute also a major bottleneck for recombinant protein production. Limitations within metabolism are mainly connected to limited supply of precursor metabolites (e.g. amino acids) or a limit in energy needed for the formation of the desired product. The focus of this PhD project was on the analysis of the impact of the metabolism on recombinant protein production in P. pastoris. In a first experiment the metabolome and fluxome of P. pastoris strains expressing different proteins were analyzed. The analysis showed that recombinant protein production directly affects intracellular amino acid pools. These findings led to the hypothesis that insufficient supply of amino acids may hamper protein production. To prove if amino acids are limiting recombinant protein production different approaches were conducted. In a first experiment amino acids were added to the cultivation media. The addition of amino acids increased the production of the antibody fragment. In an second approach the aim was to increase intracellular amino acid levels via the overexpression of genes involved in amino acid metabolism. The overexpression of 9 out of 14 engineering targets succeeded in improving the production of a recombinant carboxylesterase.