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Titelaufnahme

Titel
Metabolomics in yeast by LC-MS / submitted by Stefan Neubauer
VerfasserNeubauer, Stefan
Begutachter / BegutachterinKoellensperger, Gunda
Betreuer / BetreuerinKöllensperger, Gunda
Erschienen2012
Umfang56 Bl. : graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2012
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBb
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Analytische Chemie / Biotechnologie / Massenspektrometrie / Chromatographie / LC-MS / Metabolomik / Metabolic Profiling / Hefe / Probenvorbereitung / Nukleotid
Schlagwörter (EN)analytical chemistry / biotechnology / mass spectrometry / chromatography / LC-MS / metabolomics / metabolic profiling / yeast / sample preparation / nucleotide
Schlagwörter (GND)Hefeartige Pilze / Metabolit / Quantifizierung / Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie / Tandem-Massenspektrometrie
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-18788 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
Dateien
Metabolomics in yeast by LC-MS [9.14 mb]
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Nachweis
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Ziel der Dissertation war die Entwicklung analytischer Methoden zur Quantifizierung von Metaboliten in Hefe und Hefeprodukten. Die Methodenentwicklung umfasste hierbei sowohl die Probenvorbereitung zur Extraktion intrazellulärer Metabolite als auch die quantitative Messung dieser Metabolite mittels Flüssigkeitschromatographie (LC) in Kombination mit massenspektrometrischen Detektionsmethoden (MS). Der erste Teil der Dissertation beschäftigt sich mit der Quantifizierung von Nukleotiden in Hefeprodukten. Verschiedenste chromatographische Trennmethoden wurden untersucht, mit dem Ziel möglichst das gesamte Spektrum von Nukleotiden, Nukleosiden und Nukleobasen mit einer Methode zu erfassen. Zur Validierung der quantitativen Methode, welche auf molekülmassenspektrometrischer Detektion basiert, wurde eine komplementäre Methode basierend auf anorganischer Massenspektrometrie entwickelt. Der zweite Teil der Dissertation befasst sich mit der Quantifizierung von intrazellulären Metaboliten in Hefe. Um den Stoffwechselzustand lebender Zellen beschreiben zu können, sind eine schnelle Probennahme der intakten Zellen aus dem Fermenter, sofortige und vollständige Inaktivierung aller Enzyme und effiziente Zellextraktion unumgänglich. Verluste während der Extraktion müssen gering gehalten oder berücksichtigt werden. Ein all diesen Anforderungen entsprechendes Probenvorbereitungsprotokoll wurde für die Hefe Pichia pastoris entwickelt. Zusätzlich schuf die Herstellung vollständig 13C markierter Zellextrakte den Zugang zu 13C markierten Metaboliten. Als interner Standard verwendet, ermöglichen 13C Extrakte die Anwendung des Prinzips der Isotopenverdünnung zur Quantifizierung. Zudem wurde der isotopenmarkierte Zellextrakt zur Bestimmung von Wiederfindungsraten sowohl einzelner Probenvorbereitungsschritte als auch der gesamten Probenvorbereitung eingesetzt. Die Messung der Proben erfolgte mittels zweier orthogonaler Trennmethoden in Kombination mit MS/MS Detektion.

Zusammenfassung (Englisch)

The objective of this work is the development of quantitative methods, based on LC-MS, targeting small intracellular metabolites in yeast and yeast derived products. Development covers all aspects from sample preparation to detection by complementary separation and mass spectrometric detection systems. The first presented method is dedicated to the quantification of nucleotides, nucleosides and nucleobases by LC-MS/MS. Excellent separation of these analytes was found using a reversed phase material. Comparison with other separations revealed superior separation efficiency and lower limits of detection. Employment of ESI-triple quadrupole MS enabled selective and interference-free detection. The quantitative method was applied in nucleotide enriched yeast autolysates and it was validated by use of a complementary nucleotide detection via inductively coupled plasma MS. The second presented method deals with quantitative metabolite profiling of living yeast cells from the bioreactor. Fast sampling, the arrest of metabolic activity, efficient cell extraction and the avoidance or compensation of any losses were the main challenges here for accurate quantification. The established sample preparation, which was optimized for the yeast Pichia pastoris fulfills all requirements. The multitarget analysis of a wide range of intracellular metabolites was carried out via LC-MS/MS employing reversed phase LC, HILIC and triple quadrupole MS. Furthermore, a fully 13C labeled yeast extract was produced and its suitability as internal standard was evaluated. Within this work, this labeled cell extract was used as a tool to evaluate the recoveries and repeatability precisions of the cell extraction and the extract treatment. Finally the total combined uncertainties of the sample preparation procedure for yeast could be estimated using a model equation for uncertainty budgeting and error propagation for all input variables.