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Titelaufnahme

Titel
Chloroplast based expression of recombinant Dengue virus envelope proteins in plants / Johanna Anneliese Maria Gottschamel
VerfasserGottschamel, Johanna Anneliese Maria
Begutachter / BegutachterinBachmair, Andreas ; Lemmens, Marc
GutachterBürstmayr, Hermann ; Lössl, Andreas ; Clarke, Jihong
Erschienen2014
Umfang100 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Chloroplasten Transformation / rekombinante Proteine / Dengue Fieber
Schlagwörter (EN)chloroplast transformation / recombinant proteins / dengue fever
Schlagwörter (GND)Impfstoff / Denguefieber / Chloroplast / Plastiden-DNS / Rekombinantes Protein
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-18620 Persistent Identifier (URN)
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Chloroplast based expression of recombinant Dengue virus envelope proteins in plants [3.28 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Pflanzen sind wirtschaftliche, sichere und saubere Expressionssysteme und können als Produktionsplattformen für rekombinante Proteine mit nahezu unbegrenzter Erweiterbarkeit dienen.

Die Integration des Transgens in das Chloroplastengenom bietet den Vorteil einer gezielten und ortsspezifischen Integration und die erzielten Ausbeuten für rekombinante Proteine sind meistens höher als bei Kerntransformationen. Außerdem verhindert die maternale Vererbung von Chloroplasten in den meisten Pflanzen die Verbreitung der Transgene durch Pollen. Die zeitraubende Konstruktion von Plastiden- Transformationsvektoren kann durch die Gateway® recombinant cloning technology verkürzt werden. Die Adaption dieser Technologie für Plastiden ermöglicht eine schnelle und sehr effiziente Übertragung von DNA-Fragmenten zwischen Vektoren mit kompatiblen Rekombinationstellen.

Dies beschleunigt die Entwicklung von pharmazeutischen Produkten aus Plastiden. Dengue-Fieber bedroht mehr als 40% der Weltbevölkerung und ist die am raschesten grassierende Viruserkrankung die durch Stechmücken übertragen wird. Das Dengue-Virus wird typischerweise durch die Blut saugende, tagaktive Mücke Aedes aegypti übertragen. Das Virus tritt in vier eng verwandten, aber antigenisch und genetisch unterschiedlichen Serotypen auf (DEN 1, DEN-2, DEN DEN 3 und 4) gegen die derzeit kein Impfstoff erhältlich ist. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Chloroplasten eine geeignete und kostengünstige Produktionsplattform für einen auf dem Dengue Virus Hüllprotein Domäne III (ED III) basierenden Impfstoffkandidaten sind. Die Funktionalität des konstruierten Gateway® Plastiden-Transformationsvektor wurde zuerst durch die Expression von GFP unter Verwendung dieses Vektors in Tabak Chloroplasten überprüft.

Die rekombinanten Proteine EDIII 1 und EDIII 3 wurden durch konstitutive Expression in Tabak-Chloroplasten erzeugt, während die Expression von EDIII 1, EDIII 2, EDIII 4 und EDIII 1 4 mit dem Ethanol- induzierbaren Expressionssystem erreicht wurde. Um die Entwicklung eines oralen Impfstoff-Kandidaten zu erleichtern, wurden die Dengue Antigene EDIII 1 und EDIII 1 4 zusätzlich konstitutiv in Salat Chloroplasten produziert.

Die hier präsentierten Daten beweisen, dass die Expression der EDIII basierten Antigene in Chloroplasten möglich ist und sie tragen zur Entwicklung eines sicheren, wirksamen und erschwinglichen Impfstoffes gegen Dengue-Fieber bei.

Zusammenfassung (Englisch)

Plants are economic, safe and clean expression systems with the potential to serve as production platforms for recombinant proteins with almost unlimited scalability. Integration of transgenes into the chloroplast genome offers the advantage of targeted and site specific integration and the obtainable recombinant protein yields are mostly higher compared to nuclear transformation. Furthermore, the maternal inheritance of chloroplasts in most plant species strongly limits transmission of transgenes via pollen. The time consuming construction of plastid transformation vectors can be shortened by implementing the Gateway® recombinant cloning technology which provides a rapid and highly efficient way to transfer DNA fragments between vectors carrying compatible recombination sites. This accelerates the development of pharmaceutical products from plastids. Dengue Fever is the most rapidly spreading mosquito transmitted viral disease threatening more than 40 % of the worlds population. The Dengue virus is typically transmitted by the bite of the blood feeding, day active mosquito Aedes aegypti. The virus occurs in four closely related but antigenically and genetically distinct serotypes (DEN 1, DEN 2, DEN 3 and DEN 4) for which currently no approved vaccine is available. The present work demonstrates that chloroplasts are a suitable and cost-effective production platform for a recombinant protein vaccine candidate based on the dengue virus envelope protein domain III (EDIII). The functionality of the constructed Gateway® compatible plastid transformation vector was first proven by the expression of GFP using this vector in tobacco chloroplasts.

Transplastomic plants were generated with the biolistic method, the homoplastomic state of the regenerated plants was verified by Southern blot and protein expression levels were analysed by Western Blot. The recombinant proteins EDIII 1 and EDIII 3 were obtained through constitutive expression in tobacco chloroplasts and expression of EDIII 1, EDIII 2, EDIII 4 and EDIII 1 4 was achieved with the inducible expression system upon ethanol induction. Furthermore, the dengue antigenes EDIII 1 and EDIII 1 4 were also constitutively expressed in lettuce chloroplasts in order to facilitate the development of an oral vaccine candidate. The data obtained here demonstrate the feasibility of expressing EDIII based antigens in chloroplasts and they contribute to the development of a safe, efficacious and affordable vaccine against Dengue fever.