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Titelaufnahme

Titel
Characterization and engineering of pyranose dehydrogenases for applications in carbohydrate conversions / submitted by Iris Krondorfer
VerfasserKrondorfer, Iris
Begutachter / BegutachterinObinger, Christian ; Grabherr, Reingard
GutachterPeterbauer, Clemens K.
Erschienen2014
UmfangXI, 159 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzoeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Flavoprotein / FAD / Oxidoreduktase / Protein Engineering / Sauerstoffreaktivität / Site saturation Mutagenese / Spektroskopie / Heterologe Genexpression / Laktose / Zuckerumwandlung
Schlagwörter (EN)flavoprotein / FAD / oxidoreductase / protein engineering / oxygen reactivity / site saturation mutagenesis / spectroscopy / heterologous expression / lactose / carbohydrate conversion
Schlagwörter (GND)Kohlenhydrate / Sauerstoffaktivierung / Pyranosedehydrogenase / Proteindesign
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-18588 Persistent Identifier (URN)
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Characterization and engineering of pyranose dehydrogenases for applications in carbohydrate conversions [4.02 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Das Flavoenzym Pyranose Dehydrogenase (PDH) wird extrazellulär von ligninolytischen Basidiomyceten der Familie Agaricaceae produziert und katalysiert die Oxidation einer Vielfalt an Zuckern. Als Elektronenakzeptor dienen Benzochinone oder komplexierte Metallionen, das Enzym reagiert nicht oder nur sehr langsam mit Sauerstoff. PDH ist ein vielversprechender Kandidat für den industriellen Einsatz in Zuckerumwandlungen, der organischen Synthese oder in Biobrennstoffzellen und -sensoren. PDHs aus Agaricus meleagris, A. xanthoderma und A. campestris wurden im Zuge dieser Arbeit rekombinant in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris exprimiert, aufgereinigt und biochemisch charakterisiert. Mittels UV-Vis Spektroskopie, SDS-PAGE und TCA-Fällung wurden die Steady-state Kinetik und molekulare Eigenschaften der Proteine untersucht. Laktose-Umsetzungen im Labormaßstab zeigten die Eignung von PDH aus A. campestris und A. xanthoderma für die Produktion von Laktobionsäure und 2-Dehydrolaktose, einem wichtigen Intermediat für die Synthese von Laktulose. Da die physiologischen Elektronenakzeptoren von PDH nicht geeignet sind für den Einsatz in der Lebensmittelindustrie, wurden zwölf Site-saturation Mutantenbibliotheken von A. meleagris PDH in Saccharomyces cerevisiae exprimiert um Varianten mit erhöhter Sauerstoffreaktivität zu finden. Mutante H103Y wurde in größerem Maßstab in P. pastoris exprimiert und gereinigt. Die Charakterisierung ergab eine fünffache Steigerung der Sauerstoffreaktivität, trotz nicht-kovalent gebundenem FAD war die Mutante katalytisch aktiv, wenn auch in schwächerem Ausmaß. Stopped-flow Experimente zeigten dass ausschließlich die reduktive Halbreaktion von der Mutation negativ beeinflusst wurde. Die Stabilität der Mutante gegenüber thermischer und chemischer Denaturierung war im Vergleich zum Wildtyp verringert. Der angewandte Engineering-Ansatz bildet eine Grundlage für weitere Verbesserungen von PDH für den Einsatz in der Lebensmittelindustrie.

Zusammenfassung (Englisch)

Pyranose dehydrogenase (PDH), a fungal flavin-dependent oxidoreductase, catalyzes the oxidation of a broad variety of sugars substrates. The enzyme is unable to utilize dioxygen as an electron acceptor. Benzoquinones and complexed metal ions naturally present during lignocellulose degradation, the supposed biological function of PDH, are preferred. PDH represents a promising biocatalyst which can be applied in sugar conversions, organic synthesis or electrochemistry. For this purpose, PDHs from Agaricus meleagris, A. xanthoderma and A. campestris were recombinantly expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris, purified and characterized biochemically. Steady-state kinetic parameters and molecular properties were investigated using UV-Vis spectroscopy, SDS-PAGE and TCA precipitation. Batch lactose conversion experiments and HPLC analysis confirmed the suitability of the enzymes from A. xanthoderma and A. campestris for the production of lactobionic acid or 2-dehydrolactose, a key intermediate for the production of lactulose. The physiological electron acceptor of PDH is undesirable for an application in food technology, therefore site-saturation mutagenesis libraries of twelve amino acids in the active site of A. meleagris PDH were expressed in Saccharomyces cerevisiae. High-throughput screening resulted in one position altering oxygen reactivity. Mutant H103Y, produced in P. pastoris, showed a five-fold increase in oxygen reactivity. Although carrying a non-covalently linked FAD-cofactor in contrast to the wild-type, mutant H103Y was still catalytically active but to a lower degree. Stopped-flow experiments revealed that only the reductive half-reaction was negatively affected by the mutation. Thermal and chemical denaturation experiments were performed and confirmed the lower stability caused by the non-covalent FAD linkage. This semi-rational approach provides a scaffold for further engineering of PDH towards a highly competent biocatalyst.