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Titelaufnahme

Titel
Porous graphitized carbon chromatography coupled to mass spectrometry for the analysis of protein linked glycans with focus on isomeric structures / submitted by Martin Pabst
VerfasserPabst, Martin
Begutachter / BegutachterinAltmann, Friedrich
Betreuer / BetreuerinAltmann, Friedrich
Erschienen2009
Umfang59, [110] Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2009
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Massenspektrometrie / Flüssig Chromatographie / Glykane / Proteine / Poröser graphitierter Kohlenstoff / ESIMS / IGG / Chondrozyten / Fibrin
Schlagwörter (EN)mass spectometry / liquid chromatography / glycans / proteins / porous graphitized carbon / ESI-MS / IGG / chondrocytes / fibrine
Schlagwörter (GND)Polysaccharide / Isomer / Ultramikroanalyse / Elektrospray-Ionisation / Kohlenstoff-Nanoröhre / Wasserstoffionenkonzentration / Polysaccharide / Isomer / Ultramikroanalyse / Elektrospray-Ionisation / Kohlenstoff-Nanoröhre / Ionenstärke / Polysaccharide / Isomer / Acylneuraminsäuren / Galactose / Ultramikroanalyse / Elektrospray-Ionisation / Kohlenstoff-Nanoröhre
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-18483 Persistent Identifier (URN)
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Porous graphitized carbon chromatography coupled to mass spectrometry for the analysis of protein linked glycans with focus on isomeric structures [3.19 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Das Thema dieser Doktorarbeit umfasst die Kombination von Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie für die Analyse von Protein-gebunden Glykanen. In einer ersten Studie wurde das Potential von Fluoreszenzmarkern für Glykane bezüglich chromatographischer und massenspektrometrischer Eigenschaften evaluiert. Fluoreszenzeigenschaften sowie Signalintensität in MALDI und ESI variierten nur innerhalb eines geringen Rahmens. Glykane konnten allgemein nach Derivatisierung nur geringfügig besser detektiert werden. Im Rahmen dieser Studie wurde eine einfache Aufreinigungsmethode entwickelt, die für N- und O-Glykane anwendbar ist. Da die Vorteile des Derivatisierens relativ gering sind, fokussierte sich meine Studie in Richtung nativer Glykane mit Analyse auf porösem graphitierten Carbon, gekoppelt mit ESI-MS. Dabei wurde der Effekt der Elektrosorption von sauren Glykanen beschrieben, der Einfluss von pH Wert und Ionenstärke auf Chromatographie und weiters die Signalintensität bei positiver und negativer Ionisierung untersucht. Durch vereinfachte Probenvorbereitung und eine neue Säulenregenerationsmethode wurde eine sehr gut reproduzierbare, für Glykanmengen im fmol Bereich anwendbare Analysenmethode entwickelt. Isomere, die sich in der Bindung der Sialinsäure- bzw Galaktosereste unterscheiden, konnten mit dieser Methode anhand ihrer Retentionszeit identifiziert werden. Durch die Anwendung dieser Methode auf IgG-Glykane konnten erstmals in einem einzelnen Analysenlauf alle entsprechenden Strukturen getrennt, identifiziert und quantifiziert werden. Bei Glykan-Analysen von jeweils nur 105 Zellen humaner Chondrozyten konnte eine Verschiebung der Sialylierung von 2,6 nach 2,3 unter der Einwirkung von proinflammatorischen Cytokinen festgestellt werden. Diese Resultate stimmen mit den von unserem Kooperationspartnern an der medizinischen Universität Wien ermittelten Resultaten für die mRNA Expressionspegel der jeweiligen Sialyltransferasen überein.

Zusammenfassung (Englisch)

This doctoral thesis aimed at combining liquid chromatography and mass spectrometry for the analysis of protein-linked carbohydrates. To this end, I first evaluated the potential of labels for oligosaccharides for chromatographic and mass spectrometric applications. Fluorescence characteristics and ionization properties in matrix-assisted laser desorption and electrospray ionization varied only within a narrow range. The advantage of labeled over free glycans for mass spectrometric detection was marginal. In the course of this study, I came across a very simple post-labeling purification method applicable to N- and O-glycans. Since advantages gained from labeling of glycans are rather small, I focused on free, borohydride reduced glycans and porous graphitic carbon chromatography coupled on-line to ESI-MS. During this work, the deleterious effect of voltage-induced electrosorption for acidic glycans was described. Further, the influence of eluent pH and ionic strength on chromatographic behavior was investigated and the relative detection intensities of neutral and charged glycans in negative and positive ionization mode were determined. Finally, sample clean-up and column regeneration procedures led to a highly reproducible online LC-ESI-MS approach, suitable for low fmol amounts of glycans. Isomers, differing in the linkage of sialic acid and galactose, could be easily separated and identified on the basis of their retention times. Applying this method to the pharmacologically highly relevant immunoglobulins, we demonstrated for the first time a complete structural assignment and quantitation of neutral and sialylated glycans in single chromatographic runs from SDS PAGE bands. A glycome analysis of only 105 cultured chondrocyte cells revealed a shift from 2,6- to 2,3-sialylation in response to pro-inflammatory cytokine exposure. These results nicely correspond with mRNA expression levels of the respective sialyltransferases as analyzed by our cooperation partner from the medical University Vienna.