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Titelaufnahme

Titel
Development of genetic tools for heterologous gene expression in L. plantarum / submitted by Mag. Silvia Heiss
VerfasserHeiss, Silvia
Begutachter / BegutachterinHaltrich, Dietmar ; Schwab, Helmut
Betreuer / BetreuerinGrabherr, Reingard
ErschienenVienna, April 2016
Umfang81 Blätter : Illustrationen, Diagramme
HochschulschriftUniversität für Bodenkultur Wien, Dissertation, 2016
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Lactobacillus plantarum CD033 / Plasmid-befreiter L. plantarum 3NSH / neuartiger Replikations Mechanismus von pCD033/ BioLector Micro-Fermentation / konstitutive und induzierbare Promotor-Respressor Systeme / T7 RNA Polymerase / mCherry Proteinexpression
Schlagwörter (EN)Lactobacillus plantarum CD033 / plasmid-cured L. plantarum 3NSH / novel replication mechanism of pCD033 / BioLector micro-fermentations / constitutive and inducible promoter-repressor systems / T7 RNA polymerase / mCherry protein expression
Schlagwörter (GND)Lactobacillus plantarum / Plasmid / Rekombinantes Protein
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-18164 Persistent Identifier (URN)
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Development of genetic tools for heterologous gene expression in L. plantarum [4.46 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Milchsäurebakterien umfassen eine heterogene Gruppe Gram-positiver Bakterien mit geringem G+C Gehalt. Die größte Gattung (Lactobacillus) umfasst über 150 Spezies und kann anhand genetischer Varietät eingeteilt werden. Die Lactobacillus plantarum Gruppe ist phänotypisch sehr divers und das jeweils bevorzugte Habitat variiert stark. L. plantarum CD033 wurde aus einer stabilen Grassilage in Österreich isoliert. Eine hohe Transformationseffizienz (bis zu 109 kbe/g DNS) macht L. plantarum CD033 attraktiv für Stammverbesserung und genetische Veränderungen z.B. für die Herstellung rekombinanter Proteine. In dieser Thesis haben wir mehrere Shuttle-Vektoren, basierend auf dem L. buchneri CD034 Plasmid pCDLbu1, etabliert. Wir haben endogene konstitutive Promotoren (z.B. Ptuf33 und Ptuf34) in Plasmiden mit hoher oder geringer Kopienzahl getestet. Die optimale Distanzsequenz zwischen Shine-Dalgarno und Translationsstart wurde ermittelt. L. plantarum CD033 enthält ein 7,9 kb großes Plasmid pCD033, welches wir sequenzierten, charakterisierten und annotierten. Die Plasmidkopienzahl und das kleinstmöglich stabile Replikon wurden bestimmt und 8 codierende Sequenzen wurden gefunden. Anhand der erhaltenen Daten vermuten wir einen neuen theta-Replikationsmechanismus für dieses Plasmids. Mittels "curing plasmid" und Zugabe subletaler Dosen eines "curing agents" Novibiocin wurde L. plantarum CD033 von pCD033 befreit. Der Plasmid freie Stamm L. plantarum 3NSH wurde generiert und für die Expression rekombinanter Proteine evaluiert. Induzierbare Promotoren erweitern die Verwendung von L. plantarum. Deshalb haben wir drei Promotor/Repressor Systeme (PlacA, PxylA and PlacISynth) etabliert und in Bezug auf mCherry Expression getestet. Bevorzugte Induktoren (Laktose, Xylose und IPTG) und deren optimale Konzentrationen wurden mit dem BioLector® micro-fermentation System analysiert. Weiters konnten wir ein induzierbares System für die T7 RNA Polymerase etablieren und erstmals für L. plantarum beschreiben. Die etablierten Konstrukte sind induzierbar (gering verglichen mit einem konstitutiven Promoter) und basale Expression ohne Induktion war vorhanden. Hiermit präsentieren wir einen neuen Plasmid-freien L. plantarum Stamm und Instrumente für dessen biotechnologische Verwendung z.B. für verbesserte Silage oder zur Produktion von rekombinanten Proteinen in einem als sicher eingestuftem GRAS ("generally regarded as safe") Mikroorganismus.

Zusammenfassung (Englisch)

Lactic Acid Bacteria (LAB) are a heterogeneous group of Gram-positive bacteria with low G+C content. Lactobacillus is the largest genus, with over 150 species and can be divided into several groups based on genetic heterogeneity. Within the Lactobacillus plantarum group the diversity of phenotypical traits and preferred habitats still varies largely. L. plantarum CD033 was isolated from a stable silage in Austria. High transformation efficiencies (up to 109 cfu/g DNA) make this strain highly attractive for strain improvement by genetic engineering e.g. for the expression of recombinant proteins. This study deals with the development of genetic traits for L. plantarum. We have established a variety of suitable shuttle vectors, mainly based on high copy plasmids pCDLbu1 isolated from L. buchneri CD034. We tested endogenous constitutive promoters (e.g. Ptuf33 and Ptuf34) in either high or low copy number vectors. The optimal spacer sequence between Shine-Dalgarno sequence and translation start of reporter gene mCherry was determined. L. plantarum CD033 embodies a 7.9 kb plasmid pCD033, which was sequenced and annotated. Relative plasmid copy number of pCD033 was determined as well as the minimal stable replicon. Furthermore, we suggest replication by a novel theta mechanism. By providing a curing plasmid, and addition of sub-lethal doses of novobiocin, L. plantarum CD033 was cured of pCD033. A novel, plasmid free strain L. plantarum 3NSH was achieved, and evaluated for expression of recombinant proteins. Inducible promoters further contribute to a comprehensive use of L. plantarum as production host. Therefore, we established and characterized three different promoter/repressor systems (namely PlacA, PxylA and PlacISynth) regarding mCherry expression. We determined the preferred inducer (lactose, xylose and IPTG) and their required concentrations. Fluorescence signals and growth behavior were monitored with the BioLector® micro-fermentation system. The mCherry expression was inducible, but weak in comparison to a constitutive promoter and basal expression without inducer was observable. Furthermore, we successfully applied the T7 RNA polymerase for the first time in L. plantarum under control of an inducible promoter. This study reveals a novel plasmid free L. plantarum strain and appropriate tools for biotechnological applications e.g. enhanced silage processes or recombinant protein production in a Generally Regarded as Safe (GRAS) microorganism.