Zur Seitenansicht
 

Titelaufnahme

Titel
Development of a protein-free protocol for cell line generation and investigation of genetic parameters : early clone screening favours the selection of stable production clones / eingereicht von Christine Lattenmayer
VerfasserLattenmayer, Christine
Begutachter / BegutachterinKunert, Renate ; Dorner, Friedrich
GutachterKunert, Renate
Erschienen2007
Umfang75, [32] Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2007
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)rekombinant / CHO / proteinfrei / genetische Parameter / Screening
Schlagwörter (EN)recombinant / CHO / protein-free / genetic parameters / screening
Schlagwörter (GND)Biopharmazie / Proteine / Herstellung / Zelllinie / Klon / Screening
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-18100 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
Dateien
Development of a protein-free protocol for cell line generation and investigation of genetic parameters [5.46 mb]
Links
Nachweis
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Biopharmazeutische Proteine werden überwiegend mittels rekombinanter Zelltechnologie hergestellt. Zur Bestimmung des optimalsten Klons für die Produktion im großen Maßstab muss eine Vielzahl an Klonen gescreent werden. Deren Instabilitäten in Wachstum und Produktivität führen oft zu Verzögerungen und Kostenexplosionen im Produktionsprozess. Im Rahmen dieser Dissertation wurde das bisherige, auf Serum basierende Verfahren zur Herstellung von Zelllinien - ein Verlust in Wachstum und Produktivität war oftmals eine Folge der Adaptierung an serumfreie Bedingungen - optimiert. Die Hauptanforderungen, vergleichbare Produktionsraten und Produktqualitäten, konnten mittels unseres proteinfreien Transfektions- und Screeningprogramms erzielt werden. Die so erzeugten Klone stellen ein besseres Modell zur frühen Untersuchung von Parametern dar, die zur Bestimmung der Eignung eines Klons als Produktionsklons erforderlich sind. Ein weiterer Schwerpunkt lag in der Analyse genetischer Parameter und deren Einsatz als zusätzliche Kriterien in der Klonauswahl. Die Methode der quantitativen PCR zur Bestimmung von Gen- und mRNA-Kopienzahlen wurde systematisch angewendet. Die Untersuchung dieser Parameter in Verbindung mit der Produktivität ist daher unverzichtbar, um Engpässe in Transkription, Translation und Sekretion festzustellen. Das Risiko eines Produktivitätsabfalls sowie von Instabilitäten könnte durch die Auswahl eines in genetischen Parametern und Produktivität ausgewogenen Klons für Subklonierung, Amplifikation und Fermentation reduziert werden. Mittels FISH (Fluorescence in-situ hybridisation) wurde die Insertionsstelle in verschiedenen rekombinanten Zelllinien mit einer hohen und stabilen Produktivität untersucht, wobei verschiedenste Integrationsstellen ermittelt wurden. Durch die Entwicklung dieses Transfektionsprotokolls und dem Aufbau einer Plattform zur Analyse von genetischen Parametern konnte eine deutliche Verbesserung in der Zelllinienherstellung erzielt werden.

Zusammenfassung (Englisch)

Biopharmaceutical proteins are mainly produced using recombinant cell technology. During cell line development, a huge number of clones is screened in order to select the best clone suitable for large scale production. Problems concerning instabilities in growth and productivity often lead to a delay and remarkably higher costs in the production processes. In the framework of this thesis, the commonly used serum-based protocol for cell line generation (including an adaptation step to serum-free conditions that might result to decreased growth rates and productivities) was optimised. We could successfully demonstrate that the basic requirements for transfection of protein-free adapted host cells, namely comparable production rates as well as product qualities, are achievable by our protein-free transfection and screening program. These serum-independently generated clones might be the better model for early investigation of parameters allowing the prediction of the suitability of best producing clones. Further efforts have been undertaken in order to study genetic parameters and their use as additional criteria for clone selection. Based on our data, discussion of genetic parameters together with productivity is inevitable in order to get information about bottlenecks during transcription, translation and secretion. Screening for the most balanced clone during selection for subcloning, amplification and fermentation might reduce the potential risk of a loss in productivity and instabilities during the scale-up process. To investigate the insertion loci, the method of fluorescence in situ hybridisation (FISH) was applied to a broad range of recombinant CHO cell lines and resulted in different integration sites enabling stable and high productivities. Due to the development of the protein-free transfection protocol and the platform for analysis of genetic parameters a significant improvement in cell line development could be made.