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Titelaufnahme

Titel
Engineering of critical antibody sequences for humanization, deimmunization and germinalization with detailed analysis of their influence on production cells / eingereicht von Dipl.-Ing. Patrick Mayrhofer
Weitere Titel
Humanisierung, Deimmunisierung und Germinalisierung kritischer Antikörpersequenzen und deren Einfluss auf zelluläre Parameter
VerfasserMayrhofer, Patrick
Begutachter / BegutachterinRüker, Florian ; Betenbaugh, Michael J.
GutachterKunert, Renate ; Oostenbrink, Chris
ErschienenWien, Mai 2016
UmfangVII, 161 Bl. : Illustrationen, Diagramme
HochschulschriftUniversität für Bodenkultur Wien, Dissertation, 2016
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)chinesische Hamsterovarienzellen / CHO-K1 / DSC / DUKX-B11 / HEK293 / HIV-1 / IgG1 / scFv-Fc
Schlagwörter (EN)Chinese Hamster Ovary / CHO-K1 / DSC / DUKX-B11 / HEK293 / HIV-1 / IgG1 / scFv-Fc
Schlagwörter (GND)Humanisierung <Antikörper> / CHO-Zelle
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-17669 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
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Engineering of critical antibody sequences for humanization, deimmunization and germinalization with detailed analysis of their influence on production cells [5.34 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Antikörper-Engineering ermöglicht eine gezielte Optimierung vorteilhafter Proteineigenschaften, die durch die primäre Aminosäuresequenz bestimmt werden. Nicht-humane monoklonale Antikörper (mAk) müssen in ihrer variablen Region modifiziert werden, um immunogene Sequenzen zu entfernen, gleichzeitig aber Spezifität und Affinität konservieren. In unseren Humanisierungsstrategien wurde der anti-idiotypische Maus-mAk Ab2/3H6 verwendet und rational entworfene Frameworkmutationen eingefügt. Dann wurden die neuen 3H6 Varianten exprimiert und auf ihre Bindungseigenschaften getestet. Die dabei erhaltenen Informationen wurden in den Prozess der Humanisierung implementiert, um einen prospektiven Designzyklus von in-vitro und in-silico Methoden (molekulardynamischer Simulationen) zu entwickeln. Nicht-humane Positionen wurden zusätzlich in-silico auf T-Zell Epitope untersucht. Bei den Versuchen im Labor konnten bei einigen 3H6 Varianten nur moderate Expressionshöhen erreicht werden und in einem Fall wurde der mAk nicht in den Zellkulturüberstand segregiert. Das bestätigt die Annahme, dass die primäre Aminosäuresequenz nicht nur die Produkteigenschaften beeinflusst, sondern auch die Zellbiologie und Expressionsmaschinerie. Um diese Kausalität zu untersuchen, entwickelten wir zwei verschiedene Säugetier-Wirtszelllinien (CHO) zur zielgerichteten Genintegration unter Verwendung von Rekombinase-mediiertem Kassettenaustausch (RMCE). Verschiedene mAks wurden in RMCE-kompetenten Zellen unter isogenen Bedingungen exprimiert, sodass Positionseffekte durch unterschiedliche Integrationsloki eliminiert werden. Diese RMCE Klone wurden für Proteomik- und Metabolomik-Analysen herangezogen und der Einfluss der Proteinsequenz auf zelluläre Eigenschaften untersucht. Die präsentierten Ergebnisse zeigen wie geeignete in-silico und in-vitro Methoden aus verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen verzahnt werden können, um neue Konzepte zur Antikörperentwicklung voranzutreiben.

Zusammenfassung (Englisch)

Antibody engineering allows the rational optimization of beneficial protein properties defined by the primary amino acid sequence. Non-human monoclonal antibodies (mAb) require modification in the variable region to remove immunogenic sequences, but simultaneously need to retain specificity and affinity. Our model protein, the mouse anti-idiotypic mAb Ab2/3H6, was used for humanization strategies by introducing rationally designed framework mutations. Novel 3H6 variants were expressed and evaluated for binding affinity. The gained information was supplied to develop an upgraded humanization workflow using a prospective design cycle supported by molecular dynamics (MD) simulations. Remaining non-human residues were additionally investigated in detail using T cell epitope prediction tools. Expression of some 3H6 variants in cell culture yielded only moderate production levels and in one case the mAb could not be secreted into the cell culture supernatant. This emphasized the common assumption that the primary amino acid sequence influences not only protein properties but also the cell biology and expression machinery. To investigate these impacts we engineered two different mammalian host cell lines (CHO) for targeted gene integration using recombinase-mediated cassette exchange (RMCE). Expression in RMCE-competent cells enabled us to test different mAb variants under isogenic conditions, eliminating positioning effects resulting from disparate integration loci. We designed and expressed a set of naturally occurring antibodies and germline-derived antibodies by comparing mature antibody sequences to their closest human germline genes. Isogenic RMCE subclones were subjected to proteomics and metabolomics analyses to study the influence of the protein sequence on cellular properties. The presented results demonstrate how different in-silico and in-vitro methods from different scientific fields can be merged to develop novel concepts for antibody engineering.