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Titelaufnahme

Titel
Catabolic enzymes in the fumonisin degradation pathway of Sphingopyxis sp. MTA144 / Doris Hartinger
VerfasserHartinger, Doris
Begutachter / BegutachterinGrabherr, Reingard ; Peterbauer, Clemens
GutachterHaltrich, Dietmar
Erschienen2011
Umfang177 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2011
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Mykotoxin / Detoxifikation / Enzym / Carboxylesterase / Aminotransferase / Kinetik / Tier / E. coli / Inclusion bodies / Faltung
Schlagwörter (EN)mycotoxin / detoxification / animal / enzyme / carboxylesterase / aminotransferase / kinetics / E. coli / inclusion bodies / folding
Schlagwörter (GND)Fumonisine / Entgiftung / Escherichia coli / Carboxylesterase / Transaminasen
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-17143 Persistent Identifier (URN)
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Catabolic enzymes in the fumonisin degradation pathway of Sphingopyxis sp. MTA144 [18.44 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Fumonisine sind krebserregende Mycotoxine, die von Fusarium verticillioides und anderen phytopathogenen Pilzen produziert werden. Sie sind weltweit vor allem auf Mais zu finden und verursachen schwere Erkrankungen bei Mensch und Tier. Da chemische und physikalische Dekontaminationsmethoden Fumonisine nicht ausreichend inaktivieren können, ist unsere Strategie die biologische Entgiftung des Mykotoxins durch enzymatische Inaktivierung im Verdauungstrakt von Tieren. Wir identifizierten in einem alpha-Proteobakterium, Sphingopyxis sp. MTA144, einen Gencluster, der mit dem Fumonisinabbau in Verbindung steht. Die darin enthaltenen elf „open reading frames“ inkludierten Transkriptionsregulatoren, Transmembranproteine und katabolische Enzyme. Wir konnten die Funktion von vier Enzymen identifizieren. Der Abbauweg beginnt mit der Esterhydrolyse des FB1 durch die Carboxylesterase FumD, wodurch hydrolysiertes FB1 (HFB1) entstand, das entweder durch die Aminotransferase FumI deaminiert oder durch die Alkoholdehydrogenase FumH oxidiert wird. Die Reaktionsprodukte wurden als 2-keto-HFB1 bzw. 15-keto-HFB1 identifiziert. Das Reaktionsprodukt von beiden Enzymen, 2,15-diketo-HFB1, dient wiederum der Acetolactatsynthase FumK als bevorzugtes Substrat. Biochemische und enzymkinetische Parameter wurden für die Aminotransferase FumI bestimmt: Das bevorzugte Kosubstrat für FumI war Pyruvat. Das pH Optimum lag bei pH 8,5, das Temperaturoptimum bei 35C. Nach einstündiger Inkubation bei 60C war das Enzym vollständig inaktiviert. Restaktivität konnte nach 1 h Inkubation bei pH 4,0 oder mehr gemessen werden. Der KM Wert lag in Gegenwart von 5 mM Pyruvat bei 1.1 M, die spezifische Aktivität bei 2.2 mol/min/mg. Diese Arbeit klärte den Abbauweg von Fumonisin in Sphingopyxis sp. MTA144 auf und lieferte Enzyme für eine zukünftige Anwendung zu Entgiftung des Mykotoxins im Verdauungstrakt von Tieren.

Zusammenfassung (Englisch)

Fumonisins are mycotoxins predominantly produced by the plant pathogen Fusarium verticillioides and can be found worldwide especially in maize. Fumonisin B1 (FB1), the most abundant representative, is carcinogenic in rodents, causes porcine pulmonary edema and equine leukoencephalomalacia in livestock and human exposure to FB1 is linked to esophageal cancer and neural tube defects. FB1 is resistant to detoxification by chemical and physical methods. Therefore we are working on a biological detoxification strategy, based on enzymatic inactivation of fumonisins in the gastrointestinal tract of animals. We identified a gene cluster in Sphingopyxis sp. MTA144 which enables this alpha-proteobacterium to degrade fumonisins. Eleven open reading frames were predicted to encode proteins involved in the degradation pathway, including transcriptional regulators, transmembrane proteins and catabolic enzymes. We experimentally confirmed the function of four catabolic enzymes by heterologous gene expression followed by determination of enzyme activities. The carboxylesterase FumD catalyzed the hydrolysis of FB1. As a result, hydrolyzed FB1 (HFB1) was formed, which could either be deaminated by the aminotransferase FumI in presence of pyruvate and pyridoxal phosphate or dehydrated by the alcohol dehydrogenase FumH in presence of ß-Nicotinamide adenine dinucleotide. The resulting products of these reactions were 2-keto-HFB1 and 15-keto-HFB1, respectively. The reaction product of both enzymes, 2,15-diketo-HFB1, was the preferred substrate for the acetolactate synthase FumK. Kinetic parameters and enzyme characteristics were determined for FumI to evaluate its suitability as a feed enzyme. The preferred co-substrate of FumI was pyruvate. The enzyme was active in the range of pH 6.5 9.7 with an optimum at pH 8.5 and in a broad temperature range between 6C and 50C with an optimum at 35C. FumI was completely inactivated after 1 h incubation at 60C. Residual activity could be determined after preincubation for 1 h at pH 4.0 or higher. The KM value 1.1 M was determined with the 5 mM pyruvate. Specific activity was 2.2 mol/min/mg. In conclusion, this work elucidated the fumonisin degradation pathway of Sphingopyxis sp. MTA144 and provided enzymes for possible further application as a feed additive for gastrointestinal fumonisin detoxification.