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Titelaufnahme

Titel
Towards Pichia pastoris systems biotechnology : genome sequence, expression microarrays and genome-scale metabolic model / submitted by Alexandra Graf
VerfasserGraf, Alexandra
Begutachter / BegutachterinKreil, David Philip ; Albiol, Joan
GutachterAlbiol Sala, Joan
Erschienen2010
UmfangV, 189 Bl. : graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2010
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Pichia pastoris / Bioinformatik / Microarray / Metabolisches Modell / Sequenzierung / Genom / Transkriptom / Heterologe Protein Produktion / Systembiologie / Biotechnologie
Schlagwörter (EN)Pichia pastoris / Bioinformatics / Microarray / Metabolic model / Sequencing / Genome / Transcriptomics / Heterologous protein production / Systems Biology / Biotechnology
Schlagwörter (GND)Pichia pastoris / Genanalyse / Microarray / Stoffwechsel / Modellierung
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-16846 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
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Towards Pichia pastoris systems biotechnology [6.27 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Die methylotrophe Hefe Pichia pastoris ist ein bedeutendes Expressionssystem, welches vorrangig zur Produktion von rekombinanten Proteinen verwendet wird. Trotz der ständig wachsenden Beliebtheit dieser Zellfabrik, ist relativ wenig über ihr Genom bekannt, und zum Beginn dieser Arbeit, war keine öffentlich zugängliche Genomsequenz verfügbar. Ohne diese, ist jedoch die Anwendung von High-Throughput Methoden stark eingeschränkt, und eine systemweite Analyse nicht möglich. Nachdem das Ziel dieser Arbeit die Erstellung eines genomweiten metabolischen Modells von P. pastoris war, mussten zuerst die erforderlichen Methoden etabliert, und die für die Modellkonstruktion essentiellen Daten erzeugt werden. Der P. pastoris Stamm DSMZ 70382 wurde auf zwei 'Next-Generation-Sequencing' Platformen sequenziert, und danach funktionell annotiert. Da sowohl das Sekretom als auch die Wachstumseigenschaften wichtige Faktoren in der industriellen Biotechnologie sind, wurden die gewonnenen Genomdaten dazu verwendet um, einerseits das Sekretom von P. pastoris bioinformatisch und experimentell zu bestimmt, und andererseits die Hexosetransporter zu untersuchen. Die Resultate dieser Analyse ergaben neue und vielversprechende Erkenntnisse über die Eigenschaften dieser Hefe. Um das Genom zu visualisieren und öffentlich zugänglich zu machen, wurde ein Genom Browser implementiert. Basierend auf die funktionelle Annotation des Genoms, sowie experimentelle Daten, wurde das erste genomweite metabolischen Modell von P. pastoris entwickelt, mit dessen Hilfe die Produktion von zwei rekombinanten Proteinen (Humane Serum Albumin (HSA) und Humane Superoxid Dismutase (hSOD)) unter verschiedenen Sauerstoffaufnahmeraten, erfolgreich simuliert werden konnte. Durch die Implementierung der Proteinsynthese kann das Modell zur Vorhersage von Zielgenen für Knock-out oder Überexpressionsexperimenten verwendet werden. Mit diesen Entwicklungen ist P. pastoris nun gut gerüstet für die Systembiotechnologie.

Zusammenfassung (Englisch)

The methylotrophic yeast Pichia pastoris is one of the major eukaryotic expression systems and extensively used for the production of recombinant proteins. Due to the possible humanization of its glycosylation pattern, it is especially well suited for pharmaceutical applications. Despite the ever growing interest in this cell factory, a genome sequence of P. pastoris was not publicly available at the time of this work. Without a genome sequence, the use of high throughput technologies is drastically hampered, and the analysis of system wide responses not feasible. Applying next generation sequencing technologies, the genome of the P. pastoris type strain DSMZ 70382 was sequenced, and subsequently annotated. Using the set of putative genes, and the homology based functional annotation, the secretome of P. pastoris could be computationally predicted. The in-silico secretome was then compared to the experimentally determined secretome from a glucose cultivation. Additionally, the growth characteristics of P. pastoris was elucidated by surveying the hexose transporters present in the genome. To visualize the genomic data, a Genome Browser was implemented and made publicly available. Based on the genomic and functional data of P. pastoris, as well as experimental data from chemostat and fed-batch cultivations, the first genome-scale metabolic model of P. pastoris was created. In a validation study, the model was used to simulate the production of two heterologous proteins, namely the secreted human serum albumin (HSA) and the intracellular human superoxide dismutase (hSOD), under oxygen limiting conditions. Furthermore, the model is capable of predicting overexpression and knockout targets that have a beneficial effect on protein production. With a genome model at hand and established high throughput tools P. pastoris is now ready for Systems Biotechnology.