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Titelaufnahme

Titel
Enzymes involved in glycan processing in gastropods / submitted by Chantal Lucini
VerfasserLucini, Chantal
Begutachter / BegutachterinGrabherr, Reingard ; Strasser, Richard
GutachterStaudacher, Erika
Erschienen2014
Umfang115 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Gastropoden / Mollusken / α-1,6-Fucosyltransferase / ß-Galactosidase
Schlagwörter (EN)gastropods / molluscs / α-1,6-fucosyltransferase / ß-galactosidase
Schlagwörter (GND)Schnecken / Polysaccharide / Glycoproteinfucosyltransferase <Glycoprotein-6-alpha-L-fucosyltransferase> / Galactosidase <beta->
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-16683 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
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Enzymes involved in glycan processing in gastropods [2.84 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Es wäre hilfreich einen tieferen Einblick in die Gastropoden Glykobiologie zu gewinnen,da Strukturen und Mechanismen die nicht in höheren Tieren vorhanden sind als Werkzeug für die Schädlingsbekämpfung gezielt eingesetzt werden könnten.Der Schwerpunkt diese Arbeit lag auf zwei Enzymen:einerseits die 1,6-Fucosyltransferase, die eine Rolle bei vielen physiologischen und pathologischen Prozessen spielt;anderseits die ß-Galactosidase,die auch bei vielen biologischen Funktionen beteiligt ist.Zur Identifizierung der 1,6-Fucosyltransferase wurde doppelsträngige cDNA synthetisiert und für zwei Strategien verwendet:(1)Screening einer Expressions-cDNA-Bibliothek in Insektenzellen und (2)Homologiesuche mit degenerierten Primern.Die zweite Strategie war erfolgreich und etwa 90% der Enzymsequenz aus Arion lusitanicus wurde aufgedeckt.Die Untersuchung der Sequenz zeigte, dass die 1,6-Fucosyltransferase aus A. lusitanicus typische Eigenschaften aus der Enzymfamilie enthält.Eine lösliche Form des unvollständigen Proteins wurde in P. pastoris und in Insektenzellen exprimiert, aber es war nicht möglich,die Aktivität nachzuweisen.Zwei weitere 1,6-Fucosyltransferasen aus Mollusken wurden auch exprimiert, aber die typischen Enzymaktivitätsnachweise haben nicht funktioniert.Möglicherweise haben diese Enzyme besondere Anforderungen oder es könnte ein Zeichen dafür sein,dass inaktive Isoformen identifiziert worden sind.Zusätzlich wurden Mikrosomen aus B. glabrata und A. lusitanicus präpariert und in den Enzymaktivitätsnachweise war teilweise Aktivität sichtbar.Dennoch waren die Ergebnisse nicht zufriedenstellend und die Mikrosomenpräparation erfordert Optimierungsarbeit.Eine ß-Galactosidase aus A. lusitanicus wurde durch vier chromatographische Schritte gereinigt.Es ist gelungen,genügend Material zu sammeln, um eine Bande aus dem Coomassie Gel herauszuschneiden und durch Elektrospray Massenspektrometrie zu analysieren.Die Peptidsequenzen zeigen aber keinerlei Homologie zu Glycosidasen.

Zusammenfassung (Englisch)

To gain deeper insight into gastropods glycobiology would be an important tool for pest control, as structures and mechanisms which are not present in higher animals could be targeted specifically. In this work the focus was on two enzymes:firstly 1,6-fucosyltransferase,which plays a role in many physiological and pathological processes;secondly ß-galactosidase, which is also involved in many biological functions and is an industrially relevant enzyme.To identify the 1,6-fucosyltransferase double stranded cDNA was synthesized and used for two strategies:(1)screening of an expression cDNA library in insect cells and (2)homology search with degenerate primers.The second strategy was successful and approximately 90% of the Arion lusitanicus enzyme sequence was revealed. Sequence analysis showed that A. lusitanicus 1,6-fucosyltransferase contained sequence features typical for this enzyme family.A soluble form of the incomplete protein was expressed in P. pastoris and insect cells but it was not possible to prove its activity.Two mollusc -1,6-fucosyltransferases have also been expressed but the typical enzyme activity assays did not work.This raises questions on eventual special requirements of the enzymes or it could be a sign that inactive isoforms have been identified.Microsome preparations of B. glabrata and A. lusitanicus were also performed and enzyme activity assays gave some hints that it might be some activity. Nevertheless, the results were not satisfying and optimization work has to be done on the microsome preparation protocol.ß-galactosidase from A. lusitanicus was purified using four chromatographic steps.It was possible to get enough material to excise a band from Coomassie gel and analyze it through electrospray mass spectrometry.The peptide sequences showed no homology to any glycosidase.