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Titelaufnahme

Titel
Klonierung, Expression, biochemische Charakterisierung und Oligosaccharid-synthese durch [beta]-Galactosidase aus Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus DSM 20081 und Bifidobacterium breve DSM 20231 / eingereicht von Sheryl Lozel Arreola
VerfasserArreola, Sheryl Lozel
Begutachter / BegutachterinKneifel, Wolfgang ; Kosma, Paul
GutachterHaltrich, Dietmar
Erschienen2014
UmfangGetr. Zählung : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)beta-galactosidase / lactobacilli / bifidobacteria / galacto-oligosaccharide / hetero-oligosaccharide
Schlagwörter (EN)-Galactosidase, galacto- oligosaccharides, hetero-oligosaccharides, lactobacilli, bifidobacteria
Schlagwörter (GND)Lactobacillus delbrueckii / Galactosidase <beta-> / Oligosaccharide / Synthese / Charakterisierung
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-16588 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
Dateien
Klonierung, Expression, biochemische Charakterisierung und Oligosaccharid-synthese durch [beta]-Galactosidase aus Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus DSM 20081 und Bifidobacterium breve DSM 20231 [6.78 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Anwendung von Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus DSM 20081 und Bifidobacterium breve DSM 20213 für die Produktion des Enzyms -Galactosidase, die biochemische Charakterisierung dieser Enzyme sowie die Bildung von Galactooligosacchariden (GOS) und Heterooligosacchariden (HeOS). Während GOS bereits als Präbiotika sehr gut etabliert sind, kann auch angenommen werden, dass HeOS, die mittels dieser Enzyme aus probiotischen Organismen gebildet werden, ebenfalls präbiotische Eigenschaften aufweisen und speziell das Wachstum von Lactobazillen bzw. Bifidobakterien im Darm fördern. Das lacZ Gen aus L. bulgaricus, welches für die -Galactosidase kodiert, wurde mittels verschiedener induzierbarer Vektoren in L. plantarum WCFS1 überexprimiert, während die beiden -Galactosidasen aus B. breve, BbregalI and BbregalII, in Escherichia coli heterolog produziert wurden, wobei hier Koexpression der Chaperone GroEL/GroES notwendig war. Diese drei rekombinanten -Galactosidasen wurden anschließend im Detail biochemisch charakterisiert. Lbulgal, BbregalI und BbregalII zeigten sehr hohe Transgalactosylierungsaktivität mit Laktose als Substrat; die maximalen Ausbeuten an GOS lagen bei etwa 50, 33 und 44% relativ zu den gesamten Zuckern bei Anwendung von 200 g/L Laktose als Ausgangssubstrat. Die wichtigsten Transgalaktosylierungsprodukte von BbregalI und BbregalII waren -D-Galp-(1-6)-D-Glc und -D-Galp-(1-3)-D-Lac, während Lbulgal primär -D-Galp-(16)-D-Glc und -D-Galp-(16)-Lac bildete. Die drei Enzyme wurden ebenfalls bezüglich ihrer Eignung, auf bestimmte Zuckerakzeptoren (D-Galactose, L-Fucose, GlcNAc and GalNAc) Galaktosylreste zu übertragen, untersucht. Diese Eigenschaft wurde mittels des Partitionsverhältnisses kNu/kwater quantifiziert. Für Lbulgal und BbregalII war dieses Verhältnis für GlcNAc als Akzeptor etwa 2 bzw. 6 Mal höher als für Glucose und Lactose, was darauf hinweist, dass GlcNAc einen ausgezeichneter Akzeptor für den Galactosylrest darstellt. Bei Verwendung von Laktose als Galactosyldonor und GlcNAc als Akzeptor konnte schließlich mit beiden Enzymen -D-Galp-(1-6)-GlcNAc als Hauptprodukt in sehr guten Ausbeuten erhalten. Die Struktur dieses Produktes wurde auch mittels NMR bestätigt.

Zusammenfassung (Englisch)

The study focused on the use of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus DSM 20081 and Bifidobacterium breve DSM 20213 for the production and characterization of -galactosidase as well galacto- oligosaccharides (GOS) and hetero-oligosaccharides (HeOS) synthesis. It is anticipated that GOS and HeOS produced by these -galactosidases will be used for the specific proliferation of these bacterial genera in the gut, thus they can be considered prebiotic. The lacZ gene from L. bulgaricus was cloned into different inducible lactobacillal expression vectors for overexpression in the host strain L. plantarum WCFS1 while the two -galactosidases, BbregalI and BbregalII, from B. breve were overexpressed in Escherichia coli with co-expression of the chaperones GroEL/GroES. The three recombinant -galactosidases were purified to electrophoretic homogeneity and further characterized. When used for lactose conversion in transferase mode, Lbulgal, BbregalI and BbregalII showed very high transgalactosylation activity; the maximum yields of GOS was approximately 50, 33, and 44% of total sugars, respectively when using an initial concentration of 200 g/L lactose. The predominant transgalactosylation products of BbregalI and BbregalII are -D-Galp-(1-6)-D-Glc and -D-Galp-(1-3)-D-Lac while that of Lbulgal are -D-Galp-(16)-D-Glc and -D-Galp-(16)-Lac. Lbulgal, BbregalI, and BbregalII were also investigated with respect to their propensity to transfer galactosyl moieties onto lactose, D-glucose and D-galactose, L-fucose, GlcNAc and GalNAc under defined, initial-velocity conditions. Galactosyl transfer from Lbulgal or BbregalII to GlcNAc occurs with a partitioning ratios kNu/kwater that are 2 and 6 times those for the reactions of the galactosylated enzymes with glucose and lactose, respectively. Using lactose as galactosyl donor and GlcNAc as acceptor, Lbulgal and BbregalII synthesized -D-Galp-(1-6)-GlcNAc as the major product. The structure of this product was confirmed by NMR. These results indicate that these enzymes can be of interest for synthesis of both prebiotic GOS and HeOS.