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Titelaufnahme

Titel
Structural and mechanistic studies on eukaryotic catalase-peroxidase / submitted by Bernhard Gasselhuber
VerfasserGasselhuber, Bernhard
Begutachter / BegutachterinLudwig, Roland ; Nidetzky, Bernd
GutachterObinger, Christian
ErschienenVienna, June 2016
Umfang206 Blätter : Illustrationen, Diagramme
HochschulschriftUniversität für Bodenkultur Wien, Dissertation, 2016
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Katalase-peroxidase / Wasserstoffperoxid / Dismutation / kovalentes Addukt
Schlagwörter (EN)catalase-peroxidase / hydrogen peroxide / dismutation / covalent adduct
Schlagwörter (GND)Katalase-Peroxidase / Adduktbildung
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-16517 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
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Structural and mechanistic studies on eukaryotic catalase-peroxidase [40.04 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Phylogenetische und biochemische Studien zeigten, dass bifunktionelle Katalase-Peroxidasen (KatGs) Teil der Familie I der Peroxidase-Katalase Superfamilie sind und sowohl eine Peroxidase Aktivität als auch eine sehr effiziente Katalase Aktivität aufweisen. Erstmalig konnte eine hochaufgelöste Kristallstruktur einer eukaryotischen KatG im Ruhezustand und in der Oxoeisen(IV) Form präsentiert werden. Im Vergleich zu prokaryotischen KatGs zeigt das extrazelluläre Metalloprotein des Pilzes Magnaporthe oryzae (grisea) einige Besonderheiten, wie zwei konservierte Disulfidbrücken, die die Untereinheiten des homodimeren Proteins verknüpfen. Diese zusätzlichen Quervernetzungen erhöhen sowohl die thermische als auch die konformationelle Stabilität dieser Oxidoreduktase. Neben einem Häm b, tragen KatGs eine einzigartige posttranslationelle Modifikation, die sehr nah am aktiven Zentrum zu finden ist. Drei Aminosäuren, ein Methionin, Tyrosin und ein Tryptophan, sind kovalent miteinander verbunden. Dieses sogenannte kovalente Addukt fungiert als zusätzlicher redox-aktiver Kofaktor und ist essentiell für die Katalase-Aktivität. Diese Arbeit zeigt die wichtige Rolle des Addukts bei der Oxidation von Wasserstoffperoxid und der Freisetzung von Sauerstoff. Zerstörung des intakten Addukts durch Mutagenese führt zur kompletten Beseitigung der Katalase-Aktivität und zur Umwandlung der bifunktionellen KatG zu einem monofunktionellen Enzym. Zusätzlich wurde gezeigt, dass ein konserviertes Arginin, relativ weit weg vom aktiven Zentrum, die Katalase-Aktivität von KatGs zusätzlich moduliert. Röntgenkristallographische Strukturen bei verschiedenenen pH Werten und molekulardynamische Simulationen zeigten eine pH- abhängige Mobilität der Seitenkette. Es konnte nachgewiesen werden, dass dieses Arginin die Reaktivität des Addukts moduliert, indem es die Interaktion des zwischenzeitlich gebildeten Superoxids mit dem Adduktradikal begünstigt. Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten in Form eines postulierten Reaktionsmechanismus für die Katalase-Aktivität von KatGs zusammengefasst werden, der alle verfügbaren experimentellen Ergebnisse sowohl von prokaryotischen als auch von eukaryotischen Katalase-Peroxidasen berücksichtigt.

Zusammenfassung (Englisch)

Bifunctional catalase-peroxidases (KatGs) have been shown to be part of Family I of the peroxidase-catalase superfamily and exhibit a peroxidatic activity as well as a highly efficient catalatic activity. By utilizing the robust extracellular KatG from the fungus Magnaporthe oryzae (grisea), we present the first high resolution crystal structure of a eukaryotic KatG in its ferric resting state as well as in the oxoiron(IV) state. The structures reveal several novelties compared to prokaryotic KatGs. Importantly, the two subunits of this homodimeric protein are crosswise intertwined by two highly conserved disulphide bridges, enhancing both the thermal and conformational stability of the eukaryotic representative. Beside heme b, KatGs carry a unique posttranslational modification very close to the active site, i.e. the so called covalent adduct autocatalytically formed between the three amino acids methionine, tyrosine and tryptophan (MYW adduct). It acts as an additional redox-active cofactor that is crucial for the catalatic reaction of KatGs. We confirm the essential role of the adduct as a radical site during hydrogen peroxide turnover and demonstrate that disruption of the adduct abolishes the catalase activity and converts the bifunctional enzyme to a monofunctional peroxidase. A conserved arginine residue far from the heme b but close to the covalent adduct additionally modulates the reactivity of the MYW adduct and in consequence the catalatic reaction of KatGs. Structural investigations confirm the pH dependent movement of the arginine side chain pointing either towards the adduct or away. This pH dependent interaction of the arginine with the adduct tyrosine is further supported by molecular dynamics simulations. Altogether, the structural and mechanistic findings allow to propose a mechanism of hydrogen peroxide dismutation that is in line with experimental data from both prokaryotic and eukaryotic catalase-peroxidases.