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Titelaufnahme

Titel
Signal transduction of nitrate utilization in Aspergillus nidulans / eingereicht von Harald Berger
Weitere Titel
Signalübertragung der Nitratverwertung in Aspergillus nidulans
VerfasserBerger, Harald
Begutachter / BegutachterinStrauss, Joseph ; Obinger, Christian
Erschienen2006
UmfangVII, 167 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2006
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Nitrat / Aspergillus / AreA / NirA / GFP / chromatin
Schlagwörter (EN)Nitrate / Aspergillus / AreA / NirA / GFP / chromatin
Schlagwörter (GND)Aspergillus nidulans / Nitrate / Transkriptionsfaktor
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-15850 Persistent Identifier (URN)
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Signal transduction of nitrate utilization in Aspergillus nidulans [7.32 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Nitrate ist eine wichtige Stickstoff Quelle für Pflanzen und andere Organismen wie Pilze. Bei der Verwendung von Aspergillus nidulans als Modell Organismus für Studien der Nitrat Induktion, wurden viele Fortschritte mittels Mutagenese gemacht und die Regulatoren der Nitrat Induktion, NirA und AreA, charakterisiert. Die Interaktion dieser Regulatoren war das Ziel dieser Arbeit. Der GATA Faktor AreA, ein positiver Regulator für eine große Zahl von Stickstoff verwertenden Genen wird für die effiziente Bindung von NirA benötigt. NirA ist der spezifische Transkriptionsfaktor für Nitrat verwertende Gene. Es gehört zur Gal4 Typ binuclear Zn-cluster Familie und diese Protein Domäne wird nur in Pilzen gefunden. Wir konnten zeigen, dass NirA ein Protein ist welches sich zwischen Cytoplasma und Zellkern hin- und herbewegen kann, und dass diese unterschiedliche Lokalisation nur auf der Anwesenheit des Inducers (Nitrat, Nitrit, Chlorat) beruht, und nicht auf die Gegenwart einer primeren Stickstoffquelle wie Ammonium. In A. nidulans ist bekannt, dass Nitrat nur verwertet wird wenn keine primere Stickstoffquelle vorhanden ist, welche für diesen Pilz Ammonium und Glutamin sind. Es wurde bereits gezeigt, dass NirA unmittelbar nach der Induktion an seine Bindungsstelle im niiA - niaD Promoter bindet. Das ist ein bidirektionaler Promoter von welchem die zwei Gene divergent transkribiert werden. Auch unter induzierenden - reprimierenden Bedingungen bindet NirA, wird aber innerhalb von 20 Minuten wieder freigesetzt. Unter diesen Bedingungen erfolgt keine Transkription, aber NirA bleibt im Kern, was zu dem Schluss führt, dass die Bindung von NirA an seine Bindungsstelle keine Vorraussetzung für ein zurückhalten von NirA im Kern ist. Dieses wurde verifiziert mittels eines NirA-GFP Konstruktes, welches Mutationen in der DNA Bindungsdomäne trägt. Es wurde gezeigt, dass NirA in einem areA- Stamm nicht an seiner Zielsequenz im bidirektionalen Promoter zwischen niiA und niaD binden kann. In dieser Arbeit konnten wir allerdings zeigen, dass NirA in den Kern transportiert werden kann in der Abwesenheit von AreA, was zu dem Schluss führt, dass AreA für die Translokation von NirA nicht benötigt wird. Eine andere Funktion von AreA könnte die Rekrutierung von Komplexen für das Chromatin remodelling sein, um die Bindungstellen für NirA zugänglich zu machen. Wir konnten allerdings zeigen, dass Nucleosom -1 im bidirektionalen Promoter kein Hindernis für die NirA Bindung darstellt und diese Bindungsstelle sich in der Nucleosomen freien Region befindet. In früheren Experimenten mit micrococcal nuclease Verdau wurde gezeigt, dass in einem nirA- Stamm, zwei Stunden nach der Induktion, das Chromatin Muster verändert war. Dies führte zu dem Schluss das Chromatin remodelling strikt mit AreA verbunden ist. Unsere Experimente zeigen allerdings, dass in einem nirA- Stamm nach 20 Minuten Induktion die Zugänglichkeit der Sequenz welche von Nucleosom -1 verdeckt wird, verringert ist gegenüber der Zugänglichkeit dieser Sequenz in einem wild type Stamm, was zu dem Schluss führt, dass NirA das Potenzial enthält um Chromatin direkt oder indirekt zu remodulieren. Die Art, wie AreA die bindung von NirA an seine Zielsequenz vermittelt bleibt ungelöst aber es kann vermutet werden, dass AreA die Affinität von NirA an seine Bindungssequenz erhöht und zu mindest teilweise das chromatin remodelling beeinflusst

Zusammenfassung (Englisch)

Nitrate is an important nitrogen source in the environment for plants as well as for other organisms like fungi. By using Aspergillus nidulans as a model organism for the studies of nitrate assimilation, much progress was made from mutagenesis studies that identified NirA and AreA as key regulators of nitrate induction. Understanding the interaction of these key regulators was one aim of this work. The GATA factor AreA, is the positive acting regulator of a wide range of genes involved in the utilization of different nitrogen sources and is required for efficient binding of NirA to its DNA recognition site. NirA is the nitrate specific transcription factor and belongs to the Gal4 type binuclear Zn-cluster family, proteins only present in fungi. This thesis shows that NirA is a protein shuttling between the nucleus and the cytoplasm and accumulating in the nucleus in the presence of the inducer. This nuclear localization remains even when a repressing nitrogen source, such as ammonium, is added to induced cultures. In A. nidulans as well as in other fungi and even in plants it is known that nitrate is only utilized if no primary nitrogen source (NH4+, Glu) is available. In vivo footprinting studies have revealed that NirA is bound immediately after induction to its cognate DNA recognition site. Under induced repressed conditions NirA binds to its target site but is released within 20 minutes and no transcription occurs, but NirA still remains in the nucleus. This leads to the conclusion that the binding of NirA onto its target site is not necessary for retention of NirA in the nucleus, verified by localization studies of fluorescent tagged NirA-GFP constructs, containing mutations in the DNA binding domain. It has been shown that in an areA- strain NirA is unable to bind to its recognition site. But in this thesis it can be shown that NirA is able to translocate into the nucleus in an areA- background, leading to the conclusion that AreA is not necessary for the nuclear localization of NirA. Enzyme accessibility assays have revealed that the cognate recognition site of NirA is not occluded by a nucleosome. This makes the chromatin remodeling function of AreA dispensable concerning the binding of NirA. Microccocal nuclease digestion assays have revealed that, after two hours of induction, in a nirA- strain the chromatin pattern in this promoter is altered. This has led to the conclusion that chromatin remodeling depends strictly on AreA, but enzyme accessibility assays have revealed that in an nirA- strain after 20 minutes the accessibility of the nucleosome -1 occluded sequence is lower compared to a wild type strain, leading to the conclusion that NirA contains the ability to remodel chromatin. The way AreA facilitates NirA binding onto its target sites remains unknown. It is assumed that it changes the binding affinity of NirA to its site and has the ability to remodel chromatin