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Titelaufnahme

Titel
In vitro and in vivo study of deamidating enzymes through proteomic analysis : focus on Asparaginase, Glutaminase and Transglutaminase 2 / submitted by Narkhyun Bae
VerfasserBae, Narkhyun
GutachterAltmann, Friedrich
Erschienen2013
UmfangGetr. Zählung : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2013
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Deamidation, Proteomics, Asparaginase, Glutaminase, Transglutaminase, Massspectrometry
Schlagwörter (GND)Hausmaus / Gehirn / Asparaginase / Glutamin / Amide / Enzym
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-15390 Persistent Identifier (URN)
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In vitro and in vivo study of deamidating enzymes through proteomic analysis [10.12 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Die Desamidierung wird weithin nicht nur als ein chemisch-technisch induzierter Modifikationschritt zur Analyse in vitro sondern auch als posttranslationelle Modifikation in vivo betrachtet. Desamidierungsenzyme können in verschiedenen Gewebstypen gefunden werden. Durch Veränderung der Proteinstruktur und -funktion könnte die Desamidierung ein schneller, effektiver Weg sein, funktionelle Proteine zu modulieren. Als erstes Ziel dieser Studie wurde L-Asparaginase mittels gel-basierter proteomischer Analyse untersucht. Mehrere Modifikationen, technisch-bedingte sowie posttranslationelle, wurden nachgewiesen. Die Ergebnisse dieser Arbeit könnten die erneute Umstrukturierung des Produktes in Frage stellen, wie etwa die mögliche Beseitigung der Modifikationen durch den Hersteller, weil es nicht erwiesen ist ob sie zu ernsthaften unerwünschten Nebenwirkungen des Protein-Arzneimittels beitragen. Als zweites setzte sich die Arbeit zum Ziel eine einfache Methode zur Bestimmung der Glutamin-Desamidierung zu entwickeln. Die Desamidierungsaktivität der Transglutminase wird benutzt, um eine elektrophoretische Methode zum Screening der Proteindesamidierung aufzusetzen. Dazu wurden das rekombinante menschliche Wachstumshormon, die Membranfraktion des Rattenhippocampus, und der aus Zellhomogenat angereicherter 5-hydroxytryptamine-1-Rezeptor als Modellproteine verwendet. Desamidierung wird dann mittels unterschiedlicher Auftrennung im SDS-PAGE/Immunoblot für hydrophobe Membranrezeptorkomplexe untersucht. Desamidierung kann im Anschluss daran durch die Massenspektrometrie nachgewiesen werden. Als drittes wurde das in Glutaminase-mangelnden Mäusehirnen beeinträchtigte Proteinnetzwerk untersucht. Mittels gel-basierter proteomischer Verfahrensweisen wurden die Auswirkungen von Gls Knock-down und Knock-out untersucht. Ein durch eine Ingenuity Pathway Analyse bestimmtes Interaktionsnetzwerk legte offen, dass Gls (a) die Zellorganisation und anordnung beeinflussen und (b) in die zelluläre Signalübermittlung und den Zellzyklus involviert sind. Diese Erkenntnisse tragen zur Erweiterung des Verständnisses der Funktion der GA im laufe der Hirnentwicklung sowie hinsichtlich der Pathologie der Schizophrenie bei.

Zusammenfassung (Englisch)

Deamidation is widely considered to be not only a chemically induced artificial modifciation analytical procedures in vitro but also a post-translational modication in vivo. Deamidating enzymes are observed in various type of tissues. By altering protein structure and function, deamidation could be a rapid effective way to modulate functional proteins. In the first aim of this study, L-Asparaginase was analysed by gel-based proteomic analysis. Several modifications including technical and posttranslational modifications were demonstrated. Results from this work may challenge re-designing of the product including possible removal of the modifications by the manufacturer because it is not known whether they are contributing to the serious adverse effects of the protein drug. In the second aim, study was focused on developing a simple methodolgy to determine glutamine deamidation. The deamidating activity of transglutaminase was applied to set up a two electrophoretic method for the screen of protein deamidation using recombinant human growth hormone, a rat hippocampal membrane fraction, and a cell homogenate enriched in 5-hydroxytryptamine-1A receptor as model proteins. Deamidation is then evaluated by differential cleavage on SDS-PAGE via in situ V8 digestion and spot shifting via blue native PAGE/two-dimensional-SDS PAGE/immunoblotting for hydrophobic membrane receptor complex. Deamidation can be verified in a subsequent step by mass spectrometry. In the third aim, the protein network affected in glutaminase (GA) deficient mouse brain was investigated. Using a gel-based proteomics approach, the molecular consequences of Gls knock-down and knock-out were determined. An interaction network determined by Ingenuity Pathway Analysis revealed that Gls is involved in (a) cellular assembly and organization and (b) cell signaling and cell cycle. These findings contributed to expand the understanding of GA function involved in brain maturation and schizophrenia pathology.