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Titelaufnahme

Titel
Establishment of a continuously growing chicken embryo fibroblast cell line using chTERT / eingereicht von Herwig Stepan
VerfasserStepan, Herwig
GutachterGrillari, Johannes
Erschienen2007
Umfang81 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Dipl.-Arb., 2007
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (DE)CEF, chTERT, Telomerase, SV40, Immortalisierung
Schlagwörter (EN)CEF, chTERT, telomerase, SV40, immortalization
Schlagwörter (GND)Huhn / Fibroblast / Zelllinie
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-12071 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
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Establishment of a continuously growing chicken embryo fibroblast cell line using chTERT [3.15 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Eine Vielzahl der heutige gängigen Impfstoffe wird in Hühnereiern hergestellt. Aufgrund langer Produktionszeiten ist dies jedoch sehr unflexibel, und weißt zudem eine Reihe weiterer Nachteile auf. Primärzellen wiederum haben eine beschränkte Lebensdauer und hören nach einer gewissen Anzahl von Zellteilungen auf sich zu teilen. Eine immortalisierte Zelllinie könnte hier Abhilfe schaffen. Replikative Seneszenz wird in beinahe allen Zellen durch die Verkürzung der Telomere hervorgerufen. Allerdings kann dieser Prozess durch Telomerase verhindert werden. Es handelt sich um ein aus zwei Teilen bestehendes Ribonukleinprotein. Einerseits Telomerase RNA und andererseits die Telomerase Reverse Transcriptase (TERT). Nachdem Versuche, CEF Zellen mit humaner TERT zu immortalisieren, gescheitert sind, und die Sequenz der Hühner-TERT (chTERT) kürzlich publiziert wurde, lag es nahe eine Immortalisierung mit chTERT zu versuchen. Wir amplifizierten die chTERT Sequenz aus cDNA spezieller Hühnerzellen, und versuchten selbige in einen Expressionsvektor zu klonieren. Damit sollte in weiterer Folge eine ektopische chTERT Expression herbeigeführt werden. Wir erhofften uns eine signifikante Verlängerung der replikativen Lebensspanne bzw. sogar eine Immortalisierung. Allerdings verursachten bestimmte Abschnitte der chTERT Sequenz große Probleme sowohl bei der PCR als auch beim Klonieren. Erfolgreich konnten wir einen Vektor klonieren, der den gesamten hinteren Teil (3600 bp) in sich trägt. Die ersten 500 bp der Sequenz mussten synthetisiert werden. Allerdings war ein Zusammenführen dieser beiden Teile unmöglich, da wiederholt Mutationen und Rekombinationen auftraten. Als alternative Immortalisierungsmethode, versuchten wir virale Onkogene des Simian Virus 40 in die Zellen zu bringen. Nach erfolgreicher Transfektion konnte die Proteinexpression der viralen Proteine im Zellkern festgestellt werden, allerdings weder eine verlängerte Lebensspanne noch eine Immortalisierung erreicht werden.

Zusammenfassung (Englisch)

Nowadays, many vaccines come from chicken egg-based production systems. Due to long lead times and other disadvantages, they are very unflexible. On the other hand Primary cells have a limited life span, undergo senescence and stop proliferating after a certain number of cell divisions. An immortalized cell line could be a solution for both problems. Replicative senescence is caused by telemore shortening.. However, telomerase is known to be able to stop this process and therefore to prevent replicative senescence. Telomerase is a ribonucleo-protein consisting of two components: telomerase RNA and telomerase reverse transcriptase (TERT). Since attempts to immortalize CEF cells using human TERT have failed, and the sequence of chicken TERT (chTERT) was recently published, we wanted to attempt an immortalization using chTERT. We amplified the chTERT sequence from cDNA of special chicken cells which are known to express high levels of chTERT and tried to introduce this sequence into a mammalian expression vector. We hoped that the ectopic expression of chTERT would lead to a significantly increased replicative life span allowing more population doublings or to a complete immortalization. Unfortunately certain sections of the chTERT sequence (4100 bp) caused severe trouble at PCR amplification and vector cloning. We were able to form a vector containing the rear 3600 bp successfully and had the first 500 bp synthesized. However formation of a vector containing the complete chTERT gene was impossible due to different vector mutations when trying to introduce the whole gene. As an alternate immortalization method, we tried the introduction of viral oncogenes of the Simian Virus 40. We were successful in transfecting CEF cells with SV40, which were then expressing viral proteins in the nucleus. However they did not show a growth advantage over normal CEF cells and did not lead to increased lifespan or immortalization.