Zur Seitenansicht
 

Titelaufnahme

Titel
Characterization of novel promoters in Pichia pastoris / eingereicht von Astrid Mecklenbräuker
VerfasserMecklenbräuker, Astrid
GutachterMattanovich, Diethard
Erschienen2011
UmfangII, 87 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Dipl.-Arb., 2011
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (DE)Hefe Pichia pastoris Promotor qRT-PCR
Schlagwörter (EN)yeast Pichia pastoris promoter qRT-PCR
Schlagwörter (GND)Pichia pastoris / Promotor <Genetik>
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-11852 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
Dateien
Characterization of novel promoters in Pichia pastoris [3.58 mb]
Links
Nachweis
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Pichia pastoris wird häufig als Wirtsorganismus für die Herstellung heterologer Proteine verwendet. Verglichen mit anderen Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae, ist die Anzahl verwendbarer Promotorsequenzen relativ klein und auch limitiert auf Promotoren mit sehr starker Aktivität. Für manche Anwendungen, wie Metabolic Engineering, der Co-Expression von Sekretions-Helfern, oder der getrennten Expression von multimeren Proteinen, wie z.B. leichte (LC) und schwere Kette (HC) von Antikörpern, kann es sinnvoll sein verschiedene Promotoren mit unterschiedlichen Transkriptionsstärken zu verwenden. Es ist daher nützlich, eine Auswahl verschiedener Promotorsequenzen zu haben, variierend von starker Promotoraktivität zu schwacher oder reduzierter Promotoraktivität. In der vorliegenden Studie wurden Klone kultiviert, die entweder ein intrazelluläres Reporterprotein (verbessertes grünfluoreszierendes Protein, eGFP) oder ein sekretiertes Fremdprotein (menschliches Serumalbumin, HSA) exprimieren. Promotoraktivitäten wurden indirekt durch Messung der Genproduktmenge bestimmt. Nicht nur die Transkriptionsstärke der ausgewählten Konstrukte, sondern auch die Genkopienzahl wurde mittels quantitativer real-time PCR (qRT-PCR) bestimmt, da eine Vernachlässigung dieses Faktors zu Fehlinterpretationen der Ergebnisse führen kann. Oft führen höhere Genkopienzahlen, unabhängig von der Promotoraktivität, zu höheren Expressionsraten. Besonders PPET9, einen ADP/ATP Carrier der mitochondrialen Membran kodierend, führte zu hohen relativen Expressionsraten des intrazellulären eGFP, stattdessen gab der wachstumsabhängige PTEF1 höhere Ergebnisse mit HSA als Reporter. Fed batch Kultivierung von ausgewählten Konstrukten bestärkte die Korrelation von Promotoraktivität zu spezifischer Wachstumsrate auch für PTHI1. Allgemein resultierte eine höhere Transkriptmenge in größeren Mengen an exprimiertem Reporterprotein, mit PGAP als den Promotor mit der höchsten Transkriptmenge für beide Reporter. Es ist außerdem wichtig das Reporterprotein zu berücksichtigen, da verschiedene Gene unterschiedliche Expressionsraten unter der Kontrolle des gleichen Promotors haben. Abschließend erlaubt dies, die Expression eines gewünschten Proteins, durch die Auswahl geeigneter Promotorsequenzen abhängig von der Situation, zu regeln.

Zusammenfassung (Englisch)

The yeast Pichia pastoris is commonly used as host system for heterologous protein production. However, compared to other yeast species like Saccharomyces cerevisiae the number of useable promoter sequences is rather small and also limited to promoters having a very strong activity. For some applications, such as metabolic engineering, the co-expression of secretion helpers, or the separate expression of multimeric proteins, e.g. the light (LC) and heavy chain (HC) of antibodies, it might be of interest to use different promoters with different transcription levels. It is therefore useful to have a selection of different promoter sequences suitable for recombinant expression of a heterologous or homologous gene, varying from strong promoter activity to weak or reduced promoter activity. In the present study, clones expressing either an intracellular reporter (enhanced green fluorescent protein, eGFP) or a secreted heterologous protein (human serum albumin, HSA) were cultivated. Promoter activities were indirectly determined by measurement of the amount of gene product expressed from the promoter. Transcription levels of selected constructs were analyzed using quantitative real-time PCR (qRT-PCR), but also gene copy numbers were determined, as neglecting this factor can lead to false interpretations of experimental results. Often higher gene copy numbers lead to higher expression levels independently of promoter activity. Especially PPET9 encoding an ADP/ATP carrier of the mitochondrial membrane resulted in high relative expression levels of intracellular eGFP, whereas growth rate dependent PTEF1 gave stronger results with HSA as reporter. Fed batch cultivation of selected constructs expressing HSA strengthened the correlation of promoter activity to specific growth rates also for the PTHI1. Generally, a higher transcript level resulted in a higher amount of expressed reporter protein, with PGAP as the promoter with the highest transcriptional strength with both reporters. It is important to consider the reporter gene, as different genes have different expression levels under the control of the same promoter. In conclusion, this allows the regulation of the expression level of a protein of interest by selection of a suitable promoter sequence according to the experimental situation.