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Titelaufnahme

Titel
Vector-free cloning and heterologous expression of an endo-1,4-B-glucanase from Bacillus subtilis in Lactobacillus plantarum / submitted by Katharina Spath
VerfasserSpath, Katharina
Betreuer / BetreuerinGrabherr, Reingard
Erschienen2008
Umfang67 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Masterarb., 2008
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Lactobacillus plantarum, Endo-1,4--glucanase, vektorfreies Klonieren, Transformation, zweistufige homologe Rekombination,
Schlagwörter (EN)Lactobacillus plantarum, endo-1,4--glucanase, vector-free cloning, Transformation, two step homologous recombination
Schlagwörter (GND)Lactobacillus plantarum / Genexpression / Galactosidase <beta-> / Heubacillus
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-10874 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
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Vector-free cloning and heterologous expression of an endo-1,4-B-glucanase from Bacillus subtilis in Lactobacillus plantarum [0.57 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Milchsäurebakterien spielen bei der Konservierung von silierten Futtermitteln eine wichtige Rolle und schützen diese vor mikrobiellem und enymatischem Abbau. Die Effizienz der Konservierung hängt von der Geschwindigkeit der Ansäuerung durch die Produktion von Milchsäure ab. Die Geschwindigkeit der Ansäuerung ist wiederum abhängig von der Konzentration von wasserlöslichen Kohlenhydraten im Pflanzenmaterial, welche der limitierende Faktor für das Wachstum von Milchsäurebakterien ist. Eine Möglichkeit diese Wachstumslimitierung zu umgehen ist, die Bakterien mit Enzymen auszustatten, die fähig sind komplexe Kohlenhydrate zu hydrolysieren, wie zum Beispiel Cellulasen, Amylasen oder Xylasen. In dieser Diplomarbeit wurde ein kommerzieller Lactobacillus plantarum Stamm durch Integration einer Endo-1,4--glucanase aus Bacillus subtilis in das Wirtschromosom, genetisch modifiziert. Zu diesem Zweck wurde ein Transfervektor der eine vektorfreie Klonierung zulässt, konstruiert. Um die Transformationseffizienz zu erhöhen war es notwendig ein optimiertes Elektrotransformationsprotokoll zu etablieren. Mittels zweistufiger homologer Rekombination wurde der Transfervektor in das Chromosom von Lactobacillus plantarum integriert und unerwünschte Sequenzen wieder entfernt. Das heterologe Gen wurde dabei in das cbh Gen, welches für eine nicht essentielle dekonjugierende Gallensäurehydrolase kodiert, integriert. Der rekombinante Stamm Lactobacillus plantarum E-1,4-BG enthält nunmehr keinerlei unerwünschte Sequenzen und die Aktivität der Endo-1,4--glucanase wurde durch einen Congorot Test nachgewiesen.

Zusammenfassung (Englisch)

Lactic acid bacteria play an important role in the preservation of ensiled forages from microbial and enzymatic deterioration. The efficiency of preservation depends on the rapidity of acidification by lactic fermentation. The rate of acidification is constrained by the concentration of water-soluble carbohydrates in the row plant material as they are the growth limiting factor for lactic acid bacteria. A possibility to overcome this growth limitation is, to provide lactic acid bacteria with enzymes that are able to hydrolyse complex carbohydrates, as for example cellulases, amylases or xylanases. In this master thesis a commercial Lactobacillus plantarum strain was genetically modified by integration of an endo-1,4--glucanase gene from Bacillus subtilis into the host chromosome by a vector free cloning technique. Therefore, a transfer vector permitting vector free cloning was constructed. For the tansformation an optimized electrotransformation protocol for the Lactrobacillus plantarum strain was established. Integration of the transfer vector into the chromosome and elimination of unwanted sequences was performed by two step homologous recombination. The heterologous gene was inserted into the cbh gene, which encodes the non-essential conjugated bile hydrolase. The obtained recombinant strain Lactobacillus plantarum E-1,4-BG, contains no more unwanted vector sequences and the activity of the endo-1,4--glucanase was demonstrated by Congo red assay.