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Titelaufnahme

Titel
Structure-function analyses of the Arabidopsis E3 Ligase ARI12 and the potential substrate nCBP / eingereicht von Hann-Wei Chen
VerfasserChen, Hann-Wei
Betreuer / BetreuerinHauser, Marie-Theres
Erschienen2009
Umfang70 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Dipl.-Arb., 2009
Anmerkung
Mit dt. Zsfassung
SpracheEnglisch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (DE)Arabidopsis thaliana, E3 Ligase, ARIADNE, nCBP, EIF4E, Protein-Interaktionsanalysen, transgene Pflanzen,
Schlagwörter (EN)Arabidopsis thaliana, E3 ligase, ARIADNE, nCBP, EIF4E, protein-interaction, Yeast-Two-Hybrid, transgenic plants
Schlagwörter (GND)Ubiquitin-Protein-Ligase / Enzymkinetik / Substratspezifität
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-10212 Persistent Identifier (URN)
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Structure-function analyses of the Arabidopsis E3 Ligase ARI12 and the potential substrate nCBP [4.52 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Ubiquitin Ligasen E3 sind wichtige Proteinregulatoren. Diese Ligasen ubiquitinylieren zum größten Teil Proteine, die für das 26S Proteasom bestimmt sind und dort abgebaut werden. Je nach Ubiquitinylierungsstelle und Anzahl der transferierten Ubiquitinmoleküleinheiten entscheidet sich das Schicksal der Substrate. Die Klasse der Ubiquitin Ligasen E3 besteht aus 2 RING Domänen (RING1 und 2), die durch eine IBR Domäne unterbrochen wird. E3 Ligasen binden am Substrat und am Ubiquitin konjugierenden Enzym E2, welches aktiviertes Ubiquitin für die Ligation bereitstellt. ARI12 gehört zur Familie der RBR Ubiquitin Ligasen E3 der Modellpflanze Arabidopsis thaliana. Frühere Studien zeigten, dass ARI12 mit nCBP sowie einem Mitglied der Familie eIF4E, das eine zentrale Rolle im Binden des Caps von mRNA, mRNA Export aus dem Zellkern und in der Translationsinitiation einnimmt, interagiert. In ari12 Mutanten wurde nCBP im größeren Ausmaß vorgefunden, woraus man schließen kann, dass ARI12 die Stabilität von nCBP reguliert. Ziel meines Projektes ist die Identifizierung jener ARI12 Domänen, die mit nCBP und einem anderen Mitglied der Familie eIF4E interagieren. Zu diesem Zweck klonierte ich Teilfragmente des Gens ARI12 in Yeast Two Hybrid Vektoren und führte damit Protein-Interaktionsanalysen durch. Sowohl durch Wachstumsassays als auch unter Anwendung von Beta-Galactosidase Quantifizierungen konnte ich zeigen, dass ARI12 spezifisch mit nCBP, aber nicht mit eIF4E interagiert. Während der N-terminale Konstrukt RING1 mit nCBP Wechselwirkung zeigte, war keine Proteininteraktion bei RING2-C-Terminus mit nCBP zu beobachten. Jedoch konnte die IBR Domäne in Kombination mit RING1 oder RING2 beide Interaktionen jeweils verstärken, was darauf hinweist, dass RING1 und IBR alleine für die Interaktion mit nCBP ausreichen. Diese Resultate decken sich nicht mit jenen der homologen Gene im Menschen von ARI12 und nCBP, nämlich HHARI und 4EHP, welche nur über die RING1 Domäne miteinander interagieren. Um die biologische Funktion von ARI12 und nCBP zu untersuchen, konstruierte ich Überexpressionskonstrukte und transformierte diese in Wildtyppflanzen und Mutanten von ARI12 und nCBP. Die Charakterisierung dieser Linien geht allerdings über den Rahmen dieser Diplomarbeit hinaus.

Zusammenfassung (Englisch)

Ubiquitin ligases E3 are key protein regulators mainly known for ubiquitylating proteins targeted for degradation by the 26S proteasome. However, depending on the ubiquitylation site and number of attached ubiquitin moieties the fate of the substrate can be different. The class of RBR ubiquitin ligases E3 consist of two RING (really interesting novel gene) domains (RING1 and 2) separated by a in between RING domain (IBR). E3 ligases are known to bind both the substrate and the ubiquitin conjugating E2 enzyme which delivers the activated ubiquitin for ligation. ARI12 is a member of the RBR ubiquitin ligases E3 of Arabidopsis thaliana. Previous studies have shown that ARI12 interacts with nCBP (novel cap binding protein), a member of eIF4E (eukaryote initiation factor 4E) that play key roles in mRNA cap-binding, mRNA nucleus export and translation initiation. In ari12 mutants the abundance of nCBP is higher suggesting that ARI12 regulates nCBPs stability. The aim of my project was the identification of those ARI12 domains which interact with nCBP and another member of the eIF4E family. Therefore I cloned truncated versions of the ARI12 gene in Yeast Two Hybrid vectors and performed protein interaction assays. Using both growth assays and beta-galactosidase quantifications I could show that ARI12 interacts specifically with nCBP and not with eIF4E. While the N-terminal- RING1 construct interacts with nCBP, the RING2-C-terminal construct did not. However, both interactions were enhanced in combination with the IBR domain suggesting that the RING1 and the IBR alone are sufficient to mediate interaction with nCBP. These findings are in contrast to that of the human homologs of ARI12 and nCBP, HHARI and 4EHP, which only interact with the RING1 domain. To determine the biological role of the ARI12 and nCBP interaction I generated overexpression constructs and transformed them into wildtype and mutants of ARI12 and nCBP. The characterization of these lines is beyond this diploma thesis.