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Titelaufnahme

Titel
Analysis of expression and inhibition of microRNAs in CHO cell factories / Matthias Hackl
VerfasserHackl, Matthias
Betreuer / BetreuerinGrillari, Johannes
Erschienen2009
UmfangXI, 114 S. : Ill., zahlr. graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Masterarb., 2009
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)microRNAs, Chinese Hamster Ovary cells, miR-21, Solexa
Schlagwörter (EN)microRNAs, Chinese Hamster Ovary Zellen, miR-21, Solexa
Schlagwörter (GND)CHO-Zelle / Zelllinie / Small RNA / Genregulation / CHO-Zelle / Zelllinie / Kälteschock / Analyse / Small RNA / CHO-Zelle / Zelllinie / Natriumbutyrat / Analyse / Small RNA
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-9097 Persistent Identifier (URN)
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Analysis of expression and inhibition of microRNAs in CHO cell factories [3.39 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Zwei Strategien zur Verbesserung der Raum-Zeit Ausbeute von Bioprozessen sind derzeit etabliert: einerseits verbessert die Optimierung von Prozessführung und Nährmedien die Wachstumsbedingungen von Zellen, andererseits können intrinsische Eigenschaften von Zellen, wie Wachstumskapazität und spezifische Produktivität gentechnisch verbessert werden. Letzteres erfolgt durch gezielte Regulierung von Zellteilung, Zelltod oder Proteinsekretion - Zellprogramme die auch durch kleine RNA-Moleküle reguliert werden sogenannte microRNAs. Diese 22-nt langen nicht-kodierenden RNAs, kontrollieren die Translation ihrer target mRNAs meist durch spezifische Bindung der 3‘ UTR. Da es mit über 500 bekannten microRNAs im Menschen kaum einen zellulären Mechanismus gibt, der nicht unter ihrem Einfluss steht, könnten microRNAs zur Verbesserung von Wachstum und Produktivität von Zellfabriken wie Chinese Hamster Ovary (CHO) cells verwendet werden. Das Ziel dieser Studie war es die regulierenden Eigenschaften von microRNAs in CHO zu untersuchen. Im ersten Schritt wurde mittels Illumina/Solexa Sequencing die Sequenz von 260 CHO microRNAs ermittelt. Dabei wurde die starke Konservierung von CHO miRNAs in nahen Verwandten wie Maus, Ratte aber auch Mensch deutlich. Mithilfe der Solexa-Daten war es möglich verschiedene Zelllinien hinsichtlich ihrer microRNA Expression einzuordnen, mit dem Ergebnis dass vor allem genetische Änderungen in Zellen starke Unterschiede in der globalen microRNA expression hervorrufen, verglichen mit Effekten erzielt durch Kälteschock oder small molecule enhancers (SME). Weiters gelang die Identifikation eines potenziell durch microRNA-21 regulierten anti-apoptotischen Gens, programmed cell death 4 (PDCD4). Folglich wurde der Effekt von miRNA-21 auf Wachstum, Stressresistenz und Produktivität von CHO Zellen untersucht, aber es konnten keine signifikanten Einflüsse festgestellt werden. Um weitere microRNA Kandidaten zu finden, wurde die differentielle Expression unter biotechnologisch relevanten Konditionen untersucht. Die zuvor publizierte Regulierung von microRNA-21 bei 33C konnte dabei bestätigt werden, und die gewonnenen Daten ermöglichten ein besseres Verständnis von miRNAs in CHO und bieten gute Anhaltpunkte für die Entwicklung neuer Strategien für die Verwendung von microRNAs zur Optimierung von CHO Zellen.

Zusammenfassung (Englisch)

Manifold approaches for improving the space-time yield of a mammalian cell based process exist, ranging from process optimization to genetically improved host cells. The recent discovery of powerful RNAi regulators called microRNAs, might be used for developing an entirely new approach to cell line engineering. For most vertebrate species interactions of miRNAs with their target mRNAs result in negative regulation due to translational repression. With over 500 miRNA species identified in humans so far, there is no major pathway left that is not affected by miRNAs. Thus, microRNAs that regulate cell proliferation or cell death as well as cell transformation could be engineered in order to turn biopharmaceutical work horses, such as Chinese Hamster Ovary cells, into fast growing, high producing and stress resistant cell factories. The aim of this study was to enlarge the knowledge about microRNAs and their regulatory roles in CHO cells. We used Illumina/Solexa deep sequencing for identification of 260 distinct CHO miRNAs, which were found to be highly conserved in human and rodent species. Using the Solexa data, differences between several CHO cell lines in terms of their miRNA expression patterns were elaborated. The results indicated that changes in miRNA expression are more likely to occur on account of genetic changes such as gene amplification than due to changes in external conditions (e.g. cold-shock). Based on the identification of PDCD4 as a putative target of miR-21 in CHO and the sequence availability for cgr-miR-21, its impact on cell growth, productivity and stress resistance of a CHO production clone was assessed. It was found that under the tested conditions miR-21 did not cause significant changes in cell phenotype, presumably due to a different genetic setup of CHO cells compared to malignant cancer cells. Hence, we looked for additional microRNA targets for CHO cell engineering using microarray profiling. Therefore RNA samples were extracted at the University of Minnesota as well as at BOKU University. Real-time qPCR investigation of temperature shift RNA (33C) identified miR-21 as upregulated at 33C. Eventually, information about miRNA expression was used to draw conclusions about the miRNA setup of CHO and to discuss the relevance of miRNAs for cell engineering.