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Titelaufnahme

Titel
PhyloTrap - separate capture of bacterial and fungal small subunit ribosomal RNAs by magnetic beads / Christoph Keuschnig
VerfasserKeuschnig, Christoph
GutachterStrauss, Joseph
Erschienen2015
Umfang46 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Masterarb., 2015
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Hybridisierung, SSU rRNS isolation, magnetische Nanopartikel, Boden, SIP
Schlagwörter (EN)Hybridization, SSU rRNA capture, magnetic beads, soil, SIP
Schlagwörter (GND)Ribosomale RNS / Isolierung <Mikrobiologie> / Nanopartikel
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-7242 Persistent Identifier (URN)
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 Das Werk ist frei verfügbar
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PhyloTrap - separate capture of bacterial and fungal small subunit ribosomal RNAs by magnetic beads [3.02 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Immer noch stellt das Erforschen des Zusammenhangs zwischen der Diversität von mikrobiellen Gemeinschaften und deren Funktion und Auswirkungen auf unsere Umwelt eine Herausforderung für Ökologen dar, trotzdem sich die molekularbiologischen Methoden in den letzten zwei Dekaden wesentlich verbessert haben. Böden weisen generell eine hohe Diversität von Mikroben auf, welche globale Substratkreisläufe antreiben, sind aber wegen ihrer Komplexität ein schwierig zu untersuchendes Habitat. Speziell für nährstoffassimilierende Prozesse brauchen wir verbesserte Methoden um die Funktionsweise dieser Systeme zu verstehen, und sie, wenn nötig, gezielt zu beeinflussen. Diese Arbeit zielt darauf ab eine Methode zu entwickeln welche spezifisch bakterielle und pilzliche ribosomale RNS der kleinen Untereinheit des Ribosoms getrennt voneinander aus einer komplexen RNS Probe isoliert. Zu diesem Zweck wurde eine DNS/RNS Hybridisierung mit einer Isolierungsmethode, welche magnetische Nanopartikel nutzt, kombiniert. DNS-Sonden mit spezifischen Sequenzen (Bac338 und Euk1379) wurden auf Effizienz (Fraktion der wiedergewonnen rRNS) und Spezifizität (Isolierung des Zielmoleküls) getestet, wobei RNS von Reinkulturen sowie von Bodenproben verwendet wurden. Eine Verlängerung von Euk1379 führte zu einer 6-fachen Steigerung der Effizienz von 6.6 auf 41.5%. Eine Änderung der Länge hatte keinen Einfluss auf die Effizienz von Bac338 (20% für alle getesteten Sonden). Mit beiden Sonden konnte spezifisch rRNS aus einer Mischung von RNS aus Reinkulturen gewonnen werden. Mit Bac338 konnte erfolgreich bakterielle rRNS aus einer Bodenprobe isoliert werden. Die Ergebnisse mit Euk1379 in Bodenproben sind nicht eindeutig und bedürfen weiterer Tests. Die hier präsentierten Ergebnisse sind als vielversprechend einzustufen im Hinblick auf die Anwendbarkeit der angestrebten Methode. Eine Steigerung bei der Isolierung von pilzlicher rRNS stellt einen entscheidenden Schritt dar, da die Bereitstellung genügend RNS-Materials für die weiteren Analysenmethoden entscheidend für den Erfolg ist. Die angestrebte Methode in Kombination mit stable-isotope-probing (SIP) wird uns helfen wissenschaftliche Fragestellungen zu beantworten, die die Stickstoff-, Kohlenstoff- und Phosphatassimilationswege von pilzlichen und bakteriellen Gemeinschaften in Böden umfassen.

Zusammenfassung (Englisch)

Linking microbial diversity to function is still a challenging task for ecologists, although molecular methods have been vastly improved over the last two decades. Soil environments are generally defined by a high microbial diversity and serve as habitats for globally important communities, driving biogeochemical processes. Especially for nutrient acquisition pathways we are in need of improved tools to investigate how these complex systems function and how we might be able to alter and influence them by changing abiotic factors. In this study we aimed to develop a method to specifically separate bacterial and fungal small subunit ribosomal RNA out of a RNA sample by DNA/RNA hybridization combined with a magnetic particle capture approach. Therefore DNA-probes of specific sequences (Bac338 and Euk1379) were tested on capture efficiency (fraction of regained rRNA) and specificity (capturing the target molecule) using RNA from pure-cultures and soil. Altering the length of Euk1379 in combination with a T-linker sequence increased the capture efficiency 6-fold from 6.6 to 41.5%. Length variation showed no influence on capture efficiency of Bac338 (20% for all tested probes). Both probes showed specificity in tests with pooled RNA samples from pure-cultures. Bac338 successfully captured SSU rRNA of expected size out of the soil RNA sample, whereas results with Euk1379 were not clear and need further investigation. We consider the results of this study as very promising in regard of the applicability of the aimed method, since an increase in efficiency for the fungal RNA pool will allow us to obtain sufficient material for further downstream analysis steps. This method in combination with stable isotope probing will lead to new insights in nitrogen and carbon assimilation pathways of soil fungal and bacterial communities.