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Titelaufnahme

Titel
Generation of recombinant influenza A derived ribonucleoprotein complexes / Palmberger Dieter
VerfasserPalmberger, Dieter
GutachterGrabherr, Reingard
Erschienen2007
Umfang68 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Masterarb., 2007
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Ribonucleoproteinkomplexe, Influenza A Virus, Baculovirus,
Schlagwörter (EN)Ribonucleoproteincomplexes, Influenza A virus, Baculovirus
Schlagwörter (GND)Influenza-A-Virus / Ribonucleoproteine / Rekombinantes Protein
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-6627 Persistent Identifier (URN)
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Generation of recombinant influenza A derived ribonucleoprotein complexes [2.58 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Influenza A basierende Ribonucleoproteincomplexe (RNP) bestehen aus negativ-strängiger RNA, die von Nucleoprotein (NP) umgeben ist. Komplementäre Regionen an den 5' und 3' Enden können sich zu einer Duplexstruktur zusammenlagern, was von essentieller Bedeutung für Transkription und Replikation ist. Diese werden von einer heterotrimeren Polymerase, bestehend aus PA, PB1 und PB2 Subeinheiten, bewerkstelligt, welche an die Duplexstruktur der viralen RNA gebunden ist. Auf Grund der Tatsache das Influenza A RNP Komplexe die minimal nötigen infektiösen Partikel darstellen, wird ihre Verwendung für in vitro / in vivo Gene delivery und für die Generierung rekombinanter Viren angedacht. Eine weitere Verwendungsmöglichkeit besteht im Bereich der Impfstoffentwicklung. Das Ziel dieser Arbeit war es die 4 RNP-Proteine unter zur Hilfenahme von Baculoviren rekombinant in einem Insektenzellsystem zu exprimieren. Wir haben damit begonnen die für die RNP Bildung ideale MOI / hpi Kombination zu ermitteln und weiters versucht die Komplexe mittels Blue Native Page in ihrem nativen Zustand sichtbar zu machen. Im nächsten Schritt isolierten wir nukleäre RNP Komplexe mittels Ultracentrifugation und bestätigten deren Anwesenheit in der Pellet-Fraktion mittels Western Blot. Um die Funktionalität der viralen Polymerasen zu zeigen, wurden Sf9 Zellen mit Baculoviren die die 4 RNP-Proteine exprimieren, als auch mit Baculoviren die negativ-strängige RNA (kodiert für ein GFP Fusionsprotein) zur Verfügung stellt, infiziert. Wenn nun die Polymerasen aktiv sind, kommt es zur Expression von GFP. Um in weitere Folge die Aktivität der Polymerasen zu testen, wurden Sf9 Zellen mit Baculoviren, die RNP-Proteine codieren, infiziert, mit in vitro transkripeirter RNA transfiziert und auf GFP-Expression hin beobachtet. Die Korrektheit der in vitro transkriperten RNA konnte durch Infektion von MDCK und CHO Zellen mit dem Influenza A Stamm PR/8/34 und anschleißender RNA Transfektion gezeigt werden.

Zusammenfassung (Englisch)

The influenza A derived ribonucleoprotein (RNP) complexes consist of negative single stranded RNA covered with Nucleoprotein (NP). Complementary regions at the 5' and 3' termini can anneal to form a bulged duplex structure that is essential for transcription and replication, which is achieved by a heterotrimeric polymerase complex, consisting of PA, PB1 and PB2. The polymerase is found to be tightly associated with vRNA 5' and 3' termini. Due to the fact that RNP complexes are the minimal infectious particle of influenza A virus, they are intended for vitro / in vivo gene delivery, as well as for generation of recombinant virus. Another application is the use of RNP complexes in vaccine design. The goal of this study was to recombinantly express the 4 RNP proteins in an insect cell system, using baculovirus for gene delivery. We first established MOI / hpi combinations ideal for RNP formation in the nucleus and tried to visualize complexes in their native state, which was achieved by Blue Native page. We further attempted to isolate RNPs by velocity sedimentation and confirmed the presence of nucleoprotein in pellet fraction by western blot. To show functionality, insect cells were infected with baculovirus delivering RNP proteins together with baculovirus delivering negative single-stranded RNA coding for a GFP fusion protein. If polymerases work, negative sense RNA should be transcribed to mRNA, leading to GFP expression. For testing the activity of viral polymerases in an insect cell system, Sf9 cells were transfected with in vitro transcribed negative-stranded RNA and monitored for GFP expression. For further verifying in vitro transcribed RNA we infected CHO and MDCK cells with the influenza A strain PR/8/34 and transfected the cells with RNA. We finally observed 4 GFP expressing CHO cells leading to the assumption that in vitro transcribed RNA was correct.