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Titelaufnahme

Titel
Characterization of the myeloperoxidase mutants Q91T and R333A/K / eingereicht von Clemens Gruber
VerfasserGruber, Clemens
GutachterObinger, Christian
Erschienen2011
UmfangIII, 65 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Masterarb., 2011
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Myeloperoxidase, HEK293 Zellen, CHO Zellen, tierische Zellkultur, Proteinaufreinigung, kinetische Messungen
Schlagwörter (EN)myeloperoxidase, HEK293 cells, CHO cells, animal cell culture, protein purification, kinetic measurements
Schlagwörter (GND)Peroxidase / Rekombinantes Protein / CHO-Zelle / Zelllinie / Mensch / Embryonalzelle
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-6052 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
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Characterization of the myeloperoxidase mutants Q91T and R333A/K [1.7 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Myeloperoxidase (MPO) ist das einzige chlorierende Enzym in Säugetieren. Die prosthetische Gruppe ist ein modifiziertes Häm b, das mit drei kovalenten Bindungen an das Protein gebunden ist. Daraus resultieren einzigartige biophysikalische Eigenschaften. Aufgrund der Tatsache, dass MPO mit Hilfe von Wasserstoffperoxid aus Chlorid stark oxidierendes Hypochlorit erzeugen kann, spielt MPO eine wichtige Rolle in der unspezifischen Immunabwehr. Man findet das Hämprotein in hohen Konzentrationen in den azurophilen Granulas von phagozytierenden Neutrophilen und Monocyten. Ziel dieser Arbeit war die rekombinante Produktion zweier Mutanten mit Hilfe tierischer Zellkulturen (CHO und HEK-Zelllinien), sowie die Charakterisierung dieser Proteine hinsichtlich ihrer enzymatischen Aktivität. Die durchgeführten Aminosäureaustausche betrafen konservierte Reste auf der proximalen und distalen Hämseite (Glutamin 91 und Arginin 333). Glutamin 91 spielt eine wichtige Rolle beim Binden von kleinen anorganischen Elektronen-Donoren (z.B. Chlorid) und Arg 333 stabilisiert direkt eine Seitenkette des Häms und das Wasserstoffbrücken Netzwerk auf der proximalen Hämseite. Die Arbeit zeigt dramatische Auswirkungen der durchgeführten Mutationen auf biophysikalische Eigenschaften, enzymatische Aktivität und Einbau der prosthetischen Gruppe.

Zusammenfassung (Englisch)

Myeloperoxidase (MPO) is the only chlorinating enzyme in mammals. The prosthetic group, a modified heme b is covalently bound to the protein by three covalent bonds, which cause unique redox, chemical and spectral properties. The physiological role of MPO is to catalyze the reaction of hydrogen peroxide and chloride to yield hypochlorous acid, which is a strong oxidant and a antimicrobial agent. MPO is found in high concentration in the azurophilic granules of phagocytosing neutrophils and monocytes. The aim of this investigation was to characterize two mutants of MPO. Site directed mutagenesis was performed to specifically exchange amino acid residues located in the distal and proximal heme cavity (glutamine 91 and arginine 333). Glu91 plays a major role in binding of small inorganic electron donors and Arg333 directly interacts with heme propionate and the H-bonding partner of proximal histidine (i.e. Asn 421). The corresponding variants were recombinantly produced in CHO and HEK 293 cell cultures. Blue-shifted Soret maxima and decreased purity numbers demonstrated a significant impact of the mutations on heme modification (posttranslational modification) and autocatalytic formation of heme to protein bonds. In both Arg333 mutants the heme content was low and the activity negligible. Exchange of Gln91 decreased the peroxidase activity and totally impaired the halogenation activity. For further investigations the protein yield and heme occupancy (despite addition of heme precursor) must be increased.