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Titelaufnahme

Titel
Elucidation of [beta]-lactam conjugates and a [beta]-lactam receptor protein for their application in lateral flow devices for the detection of antibiotic residues / by Eva Esther König
VerfasserKönig, Eva Esther
GutachterKrska, Rudolf ; Baumgartner, Sabine
Erschienen2012
UmfangXIII, 85 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Masterarb., 2012
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Lateral Flow Device -Laktam-Rezeptorprotein -Laktam-Antibiotika;
Schlagwörter (EN)Lateral Flow Device -lactam receptor protein -lactam antibiotics
Schlagwörter (GND)Milch / Antibiotikum / Rückstandsanalyse
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-5961 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
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Elucidation of [beta]-lactam conjugates and a [beta]-lactam receptor protein for their application in lateral flow devices for the detection of antibiotic residues [2.61 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Der Einsatz von Lateral Flow Devices hat für das Monitoring von Kontaminationen in der Tierproduktion große Bedeutung erlangt. Ziel dieser Masterarbeit war es, die unterschiedlichen Grundbausteine eines LFDs zum Nachweis von Antibiotikarückständen zu produzieren und zu evaluieren. -Lactam Konjugate mit bovinem Serumalbumin und Ovalbumin als Trägerprotein und Tetracycline-BSA Konjugate wurden synthetisiert und als Testlinienreagenzien eingesetzt. Folgende Kopplungsverfahren wurden angewandt: die Aktivester-Methode mit N-Hydroxysuccinimid, die Carbamat-Verknüpfungsmethode und die Diazoniumkonjugation. Die synthetisierten Konjugate wurden mittels LDS-PAGE und dem 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure Assay charakterisiert. Als Detektionsreagenz wurde kolloidales Gold mit einer Partikelgröße von 40nm eingesetzt. Die Koppelung von 8 g des anti-Ampicillin-BSA Antikörpers/mL kolloidalem Gold resultierte in stabilen Goldkonjugaten. Hingegen konnte der ebenfalls kommerziell erhältliche, Protein A gereinigte anti-Tetracycline Antikörper die Goldnanopartikel nicht stabilisieren. Penicillin G-BSA Konjugate mit einer Kopplungsdichte von 1:50 wurden im Prototyp eingesetzt um den kommerziell erhältlichen polyklonalen Antikörper (Immunogen: Ampicillin-BSA) zu evaluieren. Der entwickelte Prototyp hat eine Nachweisgrenze von 0.3 ppb und ein Quantifikationsgrenze von 0.6 ppb bei der Verwendung von PenicillinG als Analyt. Demnach ist dieser polyklonale Antikörper für den Einsatz in einem LFD für die Detektion von -lactam Rückständen geeignet. Ein lösliches Derivative des Penicillin-bindenden Proteins 2x von Streptococcus pneumonia als Glutahion S-transferase Fusionsprotein wurde in E. coli BL21(DE3) exprimiert um einen Rezeptor-basierenden LFD zu entwickeln. Aufgrund der stabileren Kopplung des GST-tags an Goldpartikel war es nicht möglich PBP2x*-AuC oder PBP2x*-GST-AuC Konjugate zu erhalten, wenn eine Proteinlösung des instabilen Fusionsprotein eingesetzt wurde.

Zusammenfassung (Englisch)

To avoid using labor- and instrumental-intensive methods to detect residues of antibiotics in liquid samples, a competitive lateral flow device was developed using a commercially purchased polyclonal antibody raised against ampicillin-BSA. -lactam-protein conjugates, employing bovine serum albumin, ovalbumin, and keyhole limpet hemocyanin as carrier proteins, and tetracycline-BSA conjugates intended for use as test line capture reagent were synthesized. Those were characterized by LDS-PAGE and the 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid assay in this research. Haptens were coupled to carrier proteins via the N-hydroxysuccinimide active ester method, the carbamate linkage method, or the diazonium conjugation method. Penicillin G-BSA conjugates with a coupling ratio of 1:50 were used to set up the competitive antibody-based lateral flow device. Initial experiments resulted in a detection limit of 0.3 ppb and a limit of quantification of 0.6 ppb using penicillinG as analyte. Thus, the polyclonal antibody against ampicillin-BSA could be the basis for further investigations. As detector reagent, 40nm gold nanoparticles with an UV/Vis absorption spectroscopy maximum of 529 nm were used. Gold solution titration experiments figured out that coupling of 8 g anti-ampicillin-BSA antibody/mL colloidal gold resulted in stable gold conjugates. By contrast, the commercially obtained protein A purified anti-tetracycline antibody was not able to stabilize colloidal gold particles. Moreover, a soluble derivative of the penicillin binding protein 2x from Streptococcus pneumonia was expressed as a recombinant glutathione S-transferase fusionprotein in Escherichia coli BL21(DE3) in order to design a receptor-based strip test. Nevertheless, it was figured out that the unstable fusionprotein did not lead to PBP2x* or PBP2x*-GST labeled gold nanoparticles, since only the GST-tag moiety of the fusionprotein preferably bound to gold nanoparticles.