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Titelaufnahme

Titel
Cloning, expression and purification of human peroxidasin 1 constructs / submitted by Eva Edenhofer
VerfasserEdenhofer, Eva
GutachterPaumann-Page, Martina ; Soudi, Monika
Erschienen2014
Umfang117 Bl. : graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Dipl.-Arb., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (DE)Peroxidase-Cyclooxygenase Peroxidasin Hämprotein HEK 293 transiente Expression
Schlagwörter (EN)peroxidase-cyclooxygenase peroxidasin heme protein HEK 293 transient expression
Schlagwörter (GND)Mensch / Peroxidase / Prostaglandinsynthase / Proteinfragment / Enzymaktivität
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-5631 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
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Cloning, expression and purification of human peroxidasin 1 constructs [3.38 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Die Peroxidase-Cyclooxygenase Superfamilie ist eine von zwei Häm Peroxidase Superfamilien, welche in der angeborenen Immunabwehr, der Biosynthese der Schilddrüsenhormone und in der Bildung und Modifizierung der extrazellulären Matrix eine Rolle spielt. Das humane Peroxidasin 1 gehört zur Subfamilie 2, den so genannten Peroxidasinen, der Peroxidase-Cyclooxygenase Superfamilie und ist nah verwandt zu den Säugetier-Peroxidasen. Peroxidasine sind glykosylierte Multidomän-Oxidoreduktasen und besitzen eine Häm Peroxidase Domäne. Weiters bestehen Peroxidasine aus Leucin-reiche Wiederholungssequenzen, Immunglobulin C-ähnliche Domänen und einem von Willebrandfaktor C, welche typische Motive für Protein-Protein Interaktionen, inklusive Zelladhäsion und Mustererkennung, sind. Peroxidasin wurde erstmals in Hämozyten von Drosophila entdeckt, später wurde es auch in Säugetieren gefunden. Kürzlich wurde herausgefunden, dass es eine Rolle in der Bildung von Sulfilimin Bindungen im Kollagen IV Netzwek durch Hypohalogeniten spielt. Physiologische Studien zeigen eine Rolle in der Bildung der extrazellulären Matrix und Festigung dieser während unterschiedlicher Entwicklungsstufen. Weiters wird die Beteiligung von humanem Peroxidasin 1 in der antimikrobiellen Verteidigung vorgeschlagen. Aufgrund des bescheidenen biochemischen Wissens über diese Proteinfamilie wurden im Rahmen dieser Diplomarbeit, gekürzte Konstrukte des humanen Peroxidasin 1 für die transiente Expression hergestellt, die aus verschiedenen Domänen des vollständigen Peroxidasins bestanden. Mit den unterschiedlichen biophysikalischen Methoden, wie UV-Vis Spektroskopie, Enhanced Chemiluminescence, TMB-, ABTS- und Halogenierungsassay, konnte der Einfluss der einzelnen Domänen auf Proteinexpression und Enzymaktivität bestimmt werden. Diese Konstrukte können für zukünftige Forschung hilfreich sein für Protein-Protein Interaktionsstudien und Proteinkristallisation, um die dreidimensionale Struktur des Peroxidasins aufzuklären.

Zusammenfassung (Englisch)

The peroxidase-cyclooxygenase superfamily is one of two heme peroxidase superfamilies, which are involved in the innate immune system, in thyroid hormone biosynthesis and in modification of extracellular matrix. The human peroxidasin 1 represents the subfamily 2, called peroxidasins, of the peroxidase-cyclooxygenase superfamily and is closely related to mammalian peroxidases. They are glycosylated multidomain oxidoreductases containing a heme peroxidase domain. Furthermore, peroxidasins comprise leucine-rich repeat domains, C-like immunoglobulin domains and a von Willebrand factor C module, which are typical motifs for protein-protein interaction, including cell adhesion and pattern recognition. Peroxidasin was first detected in haemocytes of Drosophila, but was later found in mammalians as well. Recently it was found that Peroxidasin take part in the formation of sulfilimine bonds in the collagen IV network by hypohalous acids and physiological studies showed a role in extracellular matrix formation and consolidation at various developmental stages. The involvement of human peroxidasin 1 in antimicrobial defence has also been suggested. Biochemical knowledge of this protein family is very poor. Therefore, in this diploma thesis, truncated constructs of human peroxidasin 1 were generated for transient expression, each of them comprising different domains of the full length peroxidasin. In order to probe the role how the individual domains affect protein expression and enzyme activity different biophysical methods like UV-Vis spectroscopy, enhanced chemiluminescence, TMB assay, ABTS assay and halogenation assay were used. For future research these different variants can be useful for protein-protein interaction studies and protein crystallization to resolve the three dimensional structure of peroxidasin.