Zur Seitenansicht
 

Titelaufnahme

Titel
Pre steady-state studies on recombinant Myriococcum thermophilum cellobiose dehydrogenase and surface-charge variants / submitted by Bernadette Serro
VerfasserSerro, Bernadette
GutachterPeterbauer, Clemens Karl
Erschienen2010
UmfangXIV, 58 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Masterarb., 2010
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Cellobiose Dehydrogenase, Myriococcum thermophilum, Pre steady-state, Intramolekularer Elektronentransfer, FAD, heme b, Varianten
Schlagwörter (EN)cellobiose dehydrogenase, Myriococcum thermophilum, pre steady-state, intramolecular electron transfer, FAD, heme b, variants
Schlagwörter (GND)Myriococcum thermophilum / Cellobiose-Dehydrogenase
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-4731 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
Dateien
Pre steady-state studies on recombinant Myriococcum thermophilum cellobiose dehydrogenase and surface-charge variants [2.22 mb]
Links
Nachweis
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Cellobiose Dehydrogenase (CDH) katalysiert die Oxidation von Zuckern, insbesondere von Disacchariden die -1,4 glykosidisch miteinander verknüpft sind. Das natürliche Substrat welches von CDH oxidiert wird ist Cellobiose, wodurch die CDH zwei Elektronen aufnimmt und durch die Abgabe dieser an Chinone re-oxidiert wird. Schlauchpilze (Ascomycota) und Basidienpilze (Basidiomycota) welche CDH bilden und in ihre Umgebung sekretieren, spielen daher eine wichtige Rolle beim Abbau von biologischem Material. CDH ist bisher das einzig bekannte extrazelluläre Flavohaemenzym, wobei am N-terminalen Ende eine Cytochrome b Domäne über eine Linker-Sequenz mit der größeren am C-terminalen Ende befindlichen Flavodehydrogenase Domäne verbunden ist. CDH aus dem Wildtypstamm von Myriococcum thermophilum wurde rekombinant in Pichia pastoris hergestellt. Nach einem 3-stufigen Reinigungsverfahren wurde das Enzym mit der Reinheitszahl (A420/A280) von 0.64 für Pre steady-state Experiment herangezogen. Die Haem b Rate beschreibt dabei direkt den Intramolekularen Elektronentransfers (IET). Die kinetischen Konstanten Kd and klim für Cellobiose, Laktose, Glukose und Maltose wurden ermittelt und miteinander verglichen. Der klim / Kd Quotient (katalytische Effizienz) der Haem b Rate für Glukose war 3.2-fach höher als für Cellobiose. Das pH Optimum für die Reduktion von Haem b lag bei pH 4.0 (0.93 s-1), für die Flavodehydrogenase bei pH 7.0 (38.0 s-1). Die Enzymvarianten der Mutationen D547K/E550K und D547K/E550K/E603K hatten nach Mischen mit dem Substrat Glukose bei pH 7.5, herausragende Haem b Raten bei zufriedenstellende Reduktionsraten von Flavodehydrogenase. Durch die Oberflächenladungsänderungen von CDH Mutanten von Myriococcum thermophilum wurde die Umsetzung der Glukose, gemessen an der Haem b Rate, erheblich gesteigert. Die oben genannten Enzymvarianten sind daher potentielle Anwärter für Biosensoren der Dritten Generation, da sie den Direkten Elektronentransfer (DET) zwischen Redox-Zentrum des Enzyms und einer polarisierten Elektrode, fördern.

Zusammenfassung (Englisch)

Cellobiose dehydrogenase (CDH) is secreted by ascomycete and basidiomycetes fungi and catalyzes the oxidation of sugars. Its native substrate is cellobiose, a -1,4-linked disaccharide forming cellulose, thus, making CDH and important player in the biodegradation of wood. In this process, the oxidation of the natural substrate cellobiose is followed by the reduction of quinones and re-oxidation of the enzyme. CDH is the only known extracellular flavocytochrome to date, consisting of an N-terminal cytochrome domain which is connected via a linker to a larger C-terminal flavodehydrogenase domain. Heterologous expression of Myriococcum thermophilum CDH from in Pichia pastoris and its purification were core elements of this study. The highly purified enzyme with a ratio A420/A280 of 0.64 was then subjected to pre steady-state analysis. This technique allows the direct determination of intramolecular electron transfer (IET), measured by the rate constant for heme b reduction. The kinetic constants Kd and klim for cellobiose, lactose, glucose and maltose were determined. The catalytic efficiency of the heme b reduction process for glucose is outstanding, showing 3.2-fold higher value as with the natural substrate cellobiose. Highest observed rate constant of the heme b was 0.93 s-1 at pH 4.0, whereas for FAD the highest observed rate constant was 38.0 s-1 at pH 7.0. The variants D547K/E550K and D547K/E550K/E603K were found to be the most promising surface-charge variants, as they exhibit satisfying reduction performance of FAD with outstanding heme b rate constants at pH 7.5. As the surface-charge variants of CDH from Myriococcum thermophilum showed little glucose discrimination and outstanding reduction rates for heme b, they are facilitating direct electron transfer (DET) between the redox center of an enzyme and a polarized electrode and, thus, have the potential to be used in third generation biosensors.