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Titelaufnahme

Titel
Eukaryotic intracellular catalase-peroxidases : (catalase-peroxidase from Magnaporthe grisea) / submitted by Marcus Motz
VerfasserMotz, Marcus
Betreuer / BetreuerinObinger, Christian
Erschienen2014
Umfang62 Bl. : graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Masterarb., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)catalase-peroxidase, Magnaporthe grisea, reaction mechanism
Schlagwörter (EN)catalase-peroxidase, Magnaporthe grisea, reaction mechanism
Schlagwörter (GND)Reisbrenner / Katalase-Peroxidase
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-4719 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
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Eukaryotic intracellular catalase-peroxidases [6.11 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Katalase-Peroxidasen (KatGs) sind Metalloenzyme, die Häm-b enthalten, und 2 verschiedene Reaktionen vollziehen können, nämlich die Katalasereaktion (2 H2O2 2 H2O + O2) und Peroxidaseraktion (H2O2 + 2 AH2 2 H2O + 2 HA) innerhalb eines aktiven Zentrums. Zwei unterschiedliche KatG-Gruppen wurden bisher in Eukaryonten gefunden: intrazelluläre und extrazelluläre Katalase-Peroxidasen (KatG1 bzw. KatG2). Diese Arbeit beschäftigt sich mit der intrazellulären Katalase-Peroxidase von Magnaporthe grisea (MagKatG1). Exprimiert wurde MagKatG1 in Escherichia coli, die Aufreinigung des His-Tag Proteins erfolgte mittels Metallchelataffinitäts- und Hydroxyapatitchromatographie. Die Charakterisierung wurde mit Elektrophorese und anschließende Färbung mit Coomassie Brilliant Blue und Immunodetektion durchgeführt. Die kinetischen Parameter wurden photometrisch mit einem UV/Vis-Spektrophotmeter (steady-state-Kinetik) und mit einem Stopped-Flow Gerät (steady-state- und pre-steady-state-Kinetik) bestimmt. Der Reaktionsmechanismus, welcher am besten für bakterielle KatGs untersucht ist, die Bestimmung der Geschwindigkeitskontanten sowie spezielle Eigenschaften der Spektren wurden für die Reaktionen vom Grundzustand (Fe(III)-Enzym) zum Compound I (Fe(IV)-Enzym) und die Rückreaktionen erforscht, wobei folgende Substrate eingesetzt wurden: Wasserstoffperoxid, Peroxyessigsäure und Hypochlorit. MagKatG1 besitzt eine Katalaseaktivität von 27 Units mg-1 Enzym und eine Peroxidaseaktivität (Guaiacol als Substrat) von 0.013 Units mg-1 Enzym. Die Geschwindigkeit der Bildung von Compound I beträgt mit PAA 1.2 104 M-1 s-1 und mit OCl- 2 106 M-1 s-1. Die Geschwindigkeitskonstante für PAA ist vergleichbar mit der von SynKatG. Die Reaktion mit Hypochlorit zeigte zwei Intermediate, sodass drei Geschwindigkeitskonstanten für die Rückreaktion zum Fe(III)-Enzym bestimmt wurden, die zwischen 1.2 1.3 104 M-1 s-1 liegen. Alle Ergebnisse werden im Vergleich zur KatG von Synechocystis diskutiert.

Zusammenfassung (Englisch)

Catalase-peroxidases (KatGs) are bifunctional heme-b containing metalloenzymes which accomplish both catalase (2 H2O2 2 H2O + O2) and peroxidase reaction (H2O2 + 2 AH2 2 H2O + 2 HA) within a single active site. In eukaryotes, there are two groups of KatGs namely intracellular and extracellular catalase-peroxidase (KatG1 and KatG2, respectively). This work deals with the intracellular catalase-peroxidase derived from Magnaporthe grisea (MagKatG1). Expression of MagKatG1 was performed in Escherichia coli and purification of the His-tagged protein was done with metal chelate affinity chromatography (MCAC) and hydroxyapatite chromatography (HAC). Characterization was done via electrophoresis and Coomassie Brilliant Blue staining and immunodedection. Kinetic parameters were determined photometrically with a UV/VIS-spectrophotometer (Hitachi, steady-state kinetics) and a stopped-flow apparatus (Applied Photophysics, steady-state and pre-steady-state kinetics). Investigation of the reaction scheme, which is studied best for bacteria, and determination of rate constants as well as spectral characteristics were done for the reaction from ferric enzyme to Compound I (a ferryl enzyme state) and back with hydrogen peroxide (H2O2), peroxyacetic acid (PAA) and hypochlorite (OCl-). MagKatG1 shows catalase activity and peroxdase activity (for guaicacol) of 27 and 0.013 Units mg-1 enzyme, respectively. Compound I-formation was performed with peroxyacetic acid and hypochlorite and the rate constants are 1.2 104 M-1 s-1 and 2 106 M-1 s-1, respectively. The rate constant for PAA is similar to the rate constant of SynKatG. Reaction with hypochlorite showed two intermediates, so three very similar rate constants were determined for the back reaction to ferric enzyme: 1.2 1.3 104 M-1 s-1. All results are discussed in comparison to KatG of Synechocystis.