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Titelaufnahme

Titel
From endogenous to artificial promoters / submitted by Michael Meier
VerfasserMeier, Michael
GutachterGrabherr, Reingard
Erschienen2011
UmfangVII, 82 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Masterarb., 2011
Anmerkung
Mit dt. Zsfassung
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)CHO, Zellkultur, Promotor, Proteinexpression, Transkriptionsfaktoren
Schlagwörter (EN)CHO, Cellculture, Promoter, Proteinexpression, Transcriptionfactor
Schlagwörter (GND)CHO-Zelle / Promotor <Genetik>
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-3300 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
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From endogenous to artificial promoters [2.28 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Die CHO (Chinese Hamster Ovary) Zellinie ist eine der am meist genutzten Produktionssystemen zur Herstellung von rekombinanten Proteinen für therapeutische Anwendungen. Um Gene, die für diese Proteine codieren erfolgreich zu transkribieren werden derzeit relativ starke virale Promotoren genutzt. Diese Sequenzen enthalten den Cytomegalo Virus (CMV) major immediate early Promoter oder den Simian Virus 40 (SV40) immediate early Promoter. Eine ständige hohe Expressionsrate kann jedoch zu Stressreaktionen in der Zelle führen. Diese Reaktionen spiegeln sich in einer nicht korrekten Faltung von Proteinen, Inaktivierung der für das Produkt codierenden Gene, oder einer frühzeitigen Apoptose der Zellen wider.Um diese unerwünschten Reaktionen zu vermeiden könnten aus den jeweiligen Produktionszellen stammende „endogene“ Regulationselemente wie etwa Promotoren eingesetzt werden. Diese Elemente besitzen den Vorteil Teil des Zell eigenen Regulationsnetzwerkes zu sein und könnten für längere und stabilere Expressionsraten und somit höherer Produktausbeute sorgen. Ein zweiter Ansatz verfolgt die Idee bestehende in hoch transkribierten Genen vorkommende Promotoren auf bestimmte Merkmale ihrer Sequenzen hin zu untersuchen. Die zugrunde liegenden Prinzipien könnten genutzt werden um künstliche Promoter Sequenzen zu erstellen und diese in ihrer Stärke und Induzierbarkeit variabel zu gestalten. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht endogene Promotor Sequenzen mittels Chromatin-Immuno-Präzipitation (ChIP) aus CHO Zellen zu isolieren. Mit ChIP können in vivo Interaktionen von DNA und DNA-bindenden Proteinen, die eine wichtige Rolle bei der Regulation der Transkription spielen, ermittelt werden. Da keine Genom Sequenz für den Chinesischen Hamster verfügbar ist, und die isolierten Sequenzen nur geringe in vitro Promoteraktivität aufwiesen wurde ChIP auch mit einer humanen Zellline (human embryonal kidney, HEK293) durchgeführt um die Methode zu evaluieren. Im zweiten Teil wurden künstliche Promoter Sequenzen mit einem Luziferase Reporter gene assay untersucht. Mit dem Ziel Promoter Aktivität in einer vorhersagbaren Weise zu steuern wurden verschiedene Sequenz Motive analysiert. Weiters konnte die Induzierbarkeit eines künstlichen Promoters als Antwort auf einen äußeren Stimulus gezeigt werden.

Zusammenfassung (Englisch)

Mammalian expression systems are currently widely used for the production of therapeutic proteins. Among the various production hosts, the Chinese hamster ovary (CHO) cell line has reached a predominant status accounting for more than 70% of therapeutic protein production. To express heterologous genes strong viral derived promoters such as the cytomegalovirus (CMV) major immediate early promoter or the Simian Virus 40 (SV40) immediate early promoter are commonly used. High expression levels achieved with viral derived promoter sequences inflict cellular stress leading to various unwanted side effects. Common stress reactions affect correct assembly and folding of proteins, silencing of introduced heterologous genes or even lead to premature apoptosis of cells. These undesired effects could be avoided by using endogenous gene regulatory elements, which are embedded in a cells regulatory network. Another approach is to analyze existing promoter sequences for their distinctive nucleotide patterns to construct artificial promoters based on that information. In the master thesis at hand the first part describes the identification of endogenous regulatory elements using Chromatin Immunoprecipitation (ChIP). This method is used to capture in vivo protein DNA interactions occurring at promoter and enhancer regions of genes. ChIP derived sequences were analyzed with different promoter prediction programs and mapped to the human reference genome, evaluating the results with the ENCODE database for functional elements in the genome. In the second part artificial promoter constructs were analyzed using a luciferase reporter system. Different sequence motifs were introduced into the constructs, to study influence on transcriptional activity. Furthermore it was shown that promoter activity of artificial constructs comprising the known response element NFB can be induced by a stimulus with TNF.