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Titelaufnahme

Titel
Characterization of the myeloperoxidase mutant Asn421Asp produced in CHO and HEK cells / submitted by Monika Soudi
VerfasserSoudi, Monika
GutachterObinger, Christian
Erschienen2010
Umfang78 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Dipl.-Arb., 2010
SpracheEnglisch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (DE)Myeloperoxidase HEK "Human embryonal kidney cells" CHO "Chinese hamster ovary cells" Zellkultur Reinigung kinetische Charakterisierung
Schlagwörter (EN)myeloperoxidase HEK "human embryonal kidney cells" CHO "chinese hamster ovary cells" cell culture protein purification kinetic characterization
Schlagwörter (GND)Peroxidase / Rekombinantes Protein / CHO-Zelle / Zelllinie / Mensch / Embryonalzelle
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-2683 Persistent Identifier (URN)
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Characterization of the myeloperoxidase mutant Asn421Asp produced in CHO and HEK cells [1.41 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Das Hämenzym Myeloperoxidase (MPO) gehört zur Subfamilie 1 der Superfamilie der Peroxidase-Cyclooxygenasen. Mengenmäßig ist es das Hauptprotein der neutrophilen Leukozyten und wird während der Phagocytose in das Phagolysosom ausgeschüttet. Aufgrund der Tatsache, dass MPO stark oxidierende und halogenierende Reaktionsprodukte freisetzt, spielt es sowohl in der unspezifischen Immunabwehr und in der Pathogenese von entzündlichen Krankheiten eine prominente Rolle. Die prosthetische Gruppe von MPO wird während der Biosynthese post-translational modifiziert. Im Zuge dieses autokatalytischen Vorgangs wird das modifizierte Häm b über 2 Esterbindungen und einer Sulfoniumbindung mit der Proteinmatrix verknüpft. Dies moduliert signifikant die spektroskopischen und Redoxeigenschaften der prosthetischen Gruppe. In dieser Arbeit wurde die Wasserstoffbrückenbindung des proximalen Histidin mit einem hochkonservierten Asparagin durch ortsspezifische Mutagenese verändert. Rekombinantes Wildtyp Protein und die Mutante Asn421Asp wurden in tierischen Zellfabriken (CHO und HEK) hergestellt, die Kulturbedingungen und Expressionseigenschaften verglichen und optimiert. Große Mengen an rekombinanten Asn421Asp wurden schließlich in HEK-Zellen exprimiert, gereinigt und biochemisch charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Veränderung der Umgebung des proximalen Histidins sowohl die spektralen als auch die enzymkinetischen Eigenschaften dramatisch verändert hatten. Sowohl die Oxidation von Halogeniden als auch von artifiziellen Einelektronendonoren wurde teilweise stark verlangsamt. Weiters beeinflusste die eingeführte Mutation die post-translationale Mofifikation der prosthetischen Gruppe.

Zusammenfassung (Englisch)

Myeloperoxidase (MPO) is a heme containing enzyme and the most abundant protein in human neutrophils. It plays a key role in microbial killing and viral inactivation but it is also associated with tissue damage due to excessive or misplaced generation of reactive species. MPO belongs to the peroxidase-cyclooxygenase superfamily and possesses a ferriprotoporphyrin IX derivate covalently linked to the protein by autocatalytic formation of two ester bonds as well as an additional sulfonium ion linkage. This unique sulfonium linkage significantly affects the redox, spectroscopic and enzymatic properties of MPO. For a better understanding of the interactions within the active center and its surroundings the mutant variant Asn421Asp was designed in order to probe the role of Asn421, a H-bonding partner of proximal histidine, in MPO catalysis. The recombinat protein was expressed in CHO and HEK 293 cells. Since the latter was the more successful approach efforts have been made in order to optimize its productivity. After purification of the protein by a cation-exchange-chromatography spectral and kinetical characterization of the recombinant protein followed and the obtained data was compared with the properties of the wild-type enzyme. The MPO mutant showed - besides lower heme occupancy - altered modes of heme to protein linkages and enzymatic activity. The peroxidation and halogenation activity of Asn421Asp was significantly. Its chlorination activity was completely lost. Hence, exchanging the Asn421 with Asp affects the maintenance of heme cavity architecture most probably by decreasing the redox potential of the mutant protein.