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Titelaufnahme

Titel
Evaluation of recombinase mediated cassette exchange for recombinant protein production in CHO cells / submitted by Bernhard Kratzer
VerfasserKratzer, Bernhard
Betreuer / BetreuerinKunert, Renate ; Mader, Alexander
Erschienen2013
UmfangVII, 107 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Masterarb., 2013
Anmerkung
Mit dt. Zsfassung
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)CHO Zellen Recombinase vermittelter Kassettenaustausch (RMCE) rekombinante Protein Expression Anti HIV-1 Antikörper FISH
Schlagwörter (EN)CHO recombinase mediated cassette exchange (RMCE) recombinant protein expression anti HIV-1 antibodies FISH
Schlagwörter (GND)Genexpression / Antikörper / CHO-Zelle / RMCE-Kassettenaustauschverfahren
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-2576 Persistent Identifier (URN)
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Evaluation of recombinase mediated cassette exchange for recombinant protein production in CHO cells [2.44 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Rekombinante Antikörper zählen zu den wichtigsten Biopharmazeutika. Diese werden häufig in rekombinanten Ovarienzellen des Chinesischen Goldhamsters produziert. Die traditionelle Entwicklung einer solchen Zelllinie basiert auf der zufälligen Integration eines Plasmid mit dem Gen für das rekombinante Protein in das Genom. Um jedoch das Gen gezielt an einem hochaktiven Ort im Genom zu integrieren, wurde der Rekombinase vermittelte Kassettenaustausch (RMCE) entwickelt. Dabei erkennt die Rekombinase Flipase bestimmte DNA Sequenzen und ermöglicht durch die Verwendung von heterospezifischen Erkennungsstellen einen Kassettenaustausch. In der vorliegenden Arbeit wurden die beiden Anti-HIV-1 Antikörper 2F5 und 3D6, beide als sc Fv-Fc (scFc) Varianten, mit dieser Technik produziert. Dafür erfolgte eine Kotransfektion der RMCE kompetenten Zelllinie mit 3D6scFc oder 2F5scFc und dem Enzyms Flipase. Die zwölf bestproduzierenden Klone je scFc Zelllinie wurden in T25 Flaschen kultiviert und jeweils die beiden höchstproduzierenden Klone in Spinnnerflaschen weiterkultiviert. Die so entstandenen vier Zelllinien wurden unter besonderer Berücksichtigung des Kassettenaustausches intensiv mittels FISH und quantitativer PCR charakterisiert. Dadurch zeigte sich, dass eine Zelllinie eine zusätzliche Transgenkopie aufwies, während alle anderen Ziellinien die gleiche Anzahl an Transgenkopien vor und nach dem Kassettenaustausch hatten. Außerdem wurde eine höhere spezifische Produktivität der Zelllinien für 3D6scFc ermittelt, obwohl die spezifische Wachstumsrate, der Metabolismus und die Transkriptmenge in all den Zelllinien annähernd ident waren. Nur die interzelluläre Produktbildung zeigte zwischen 3D6scFc und 2F5scFc produzierenden Zellen Unterschiede, nicht jedoch in dem Maße wie die spezifische Produktbildungsrate. Die durchgeführte Arbeit bestätigt die Möglichkeit von RMCE für die rekombinante Proteinexpression sowie den Einfluss des exprimierten Proteins auf die spezifische Produktivität.

Zusammenfassung (Englisch)

Recombinant antibodies are the most important class of biopharmaceuticals. They are commonly produced in recombinant Chinese Hamster Ovary (CHO) cells. Traditional concepts for the creation of such cell lines rely on the random integration of the plasmid, containing the gene of interest, in the genome. To preselect a transcriptionally active genomic locus prior to transfection the recombinase mediated cassette exchange (RMCE) was developed. The recombinase Flipase recognises distinct DNA sequences and by the use of heterospecific recognition sites a cassette exchange is possible. Within this study, the two anti HIV-1 antibodies 2F5 and 3D6, both designed as single chain Fv-Fc (scFc) variant, were produced and compared by this technique. Therefore a RMCE competent CHO host cell line was cotransfected with either 2F5scFc or 3D6scFc and the enzyme Flipase. The twelve best producing clones of each scFc producing cell line were grown in T25 flask and the two best producers of each were selected for cultivation in spinner flasks. Those four cell lines were intensively characterised and special emphasis was laid on the detailed investigation of the RMCE. This characterisation was done by FISH and quantitative real time PCR. It turned out, that one cell line harboured an additional transgene copy, although the three other cell lines had the same gene copy number as the cell line prior to cassette exchange. Another difference was the higher specific productivity of the 3D6scFc producing cell lines, although the transcript level, specific growth rate and the metabolism remained almost the same in all scFc producing cell lines. Only the intercellular product formation was slightly higher for 3D6scFc producing cell lines than for 2F5scFc producing cell lines, but not in the dimension of the specific productivity. This study demonstrated the ability of RMCE for recombinant protein production and also the influence of the product itself on the specific productivity.