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Titelaufnahme

Titel
Platform technology for the production of therapeutic antibody fragments in Escherichia coli : evaluation of Escherichia coli as host system for the production of scFv- and Fab fragments in biopharmaceutical industry / Michael Graf
VerfasserGraf, Michael
Betreuer / BetreuerinMattanovich, Diethard
Erschienen2009
UmfangVIII, 102 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Masterarb., 2009
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Plattformtechnologie Rekombinante Proteinproduktion Therapeutische Antikörperfragmente Escherichia coli Fermentation Klonen
Schlagwörter (EN)Platform Technology Recombinant Protein Production Therapeutic Antibody Fragments Escherichia coli Fermentation Cloning
Schlagwörter (GND)Escherichia coli / Fc-Fragment / Gentechnisch erzeugtes Produkt
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-2462 Persistent Identifier (URN)
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Platform technology for the production of therapeutic antibody fragments in Escherichia coli [1.53 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die jüngsten Fortschritte in der Konstruktion und Produktion von Antikörpern führten zu einer Reihe neuer Antikörper-Therapeutika auf dem biopharmazeutischen Markt. Wegen ihrer geringen Größe können Antikörperfragmente einfach und kostengünstig in mikrobiellen Wirtssystemen hergestellt werden. Diese Arbeit beschreibt den Aufbau einer Produktionsplattform um generisches Wissen über die intrazelluläre Expression dieser Fragmente in E. coli zu erlangen. Es wurden die E. coli Stämme B und A zur intrazellulären Expression der single-chain Fragmente (scFv) der mAbs H6, B1, und A4 untersucht. Außerdem wurden die einzelnen Ketten des antigen-binding Fragments (Fab) von A4 getrennt voneinander in E. coli Stamm A exprimiert. In Fermentationen beider Stämme bei 35C wurden volumetrische Konzentrationen zwischen 5,9 g/L und 8,4 g/L für H6- und A4 scFv erhalten. Die volumetrischen Konzentrationen von B1 scFv war hingegen nur 3,1 g/L in beiden Stämmen. Weiterführend wurde der Einfluss der Expressionstemperatur auf die intrazelluläre Ausbeute und Löslichkeit von B1 scFv in beiden Stämmen untersucht. Eine Expressionstemperatur von 28C verringerte die volumetrische Konzentration von B1 scFv auf 1,5 g/L in Stamm B und 2,1 g/L in Stamm A. Eine Expressionstemperatur von 42C verringerte die volumetrische Produktivität auf 1,8 g/L in Stamm B und 2,0 g/L in Stamm A. Bei keiner Expressionstemperatur konnte eine lösliche Fraktion von B1 scFv nachgewiesen werden. Anschließend wurde der Einfluss des Linker Peptids auf die intrazelluläre B1 scFv Ausbeute und Löslichkeit in E. coli Stamm A untersucht. Statt dem (Gly4Ser)3 Linker wurden vier verschiedene Linker Peptide in B1 scFv eingefügt. B1 scFv mit dem E-Linker, L205 oder LLB18 ergaben ähnliche Konzentrationen (3,2 g/L, 4,0 g/L und 3,8 g/L). B1 scFv mit dem L218 linker ergab einen viel höheren Wert (8,9 g/L). Keiner der neu eingeführten Linker bewirkte eine intrazelluläre Löslichkeit von B1 scFv. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die intrazellulären Expression von Fab Fragmenten in E. coli Stamm A zu untersuchen. Die einzelnen Ketten des A4 Fab Heterodimers wurden als dazu verwendet. Die leichte Kette ergab 14,2 g/L und die schwere Kette 11,7 g/L. Daher erwies sich die intrazelluläre Expression der einzelnen A4 Fab Ketten als vielversprechende Expressionsstrategie.

Zusammenfassung (Englisch)

Latest advances in antibody- engineering and production have led to a broad variety of novel antibody therapeutics now entering the biopharmaceutical market. Owing to their reduced size antibody fragments can be produced easily and therefore less costly in microbial host systems. This work describes the establishment of a manufacturing platform to gain generic knowledge about the intracellular expression of these formats in E. coli. The hosts E. coli Strain B and Strain A were evaluated for expressing the single-chain-fragment (scFv) of the mAbs H6, B1, and A4. Furthermore, E. coli Strain A was investigated for expressing the individual chains of antigen-binding-fragment (Fab) of mAb A4. At 35C, fermentations with both strains expressing H6- and A4 scFv yielded volumetric concentrations from 5.9 g/L to 8.4 g/L. However, volumetric B1 scFv concentrations were only 3.1 g/L in both strains. In a next step, the influence of expression temperature on intracellular B1 scFv yield and solubility in both strains was investigated. Lowering the expression temperature to 28C decreased the volumetric concentration of B1 scFv to 1.5 g/L for Strain B and 2.1 g/L for Strain A. Increasing the expression temperature to 42C also decreased the volumetric concentration to 1.8 g/L for Strain B and 2.0 g/L for Strain A. No soluble fraction of B1 scFv could be detected at any expression temperature. Subsequently, the influence of the linker peptide on intracellular B1 scFv yield and solubility was investigated in E. coli Strain A. Four different linker peptides were introduced into B1 scFv replacing the original (Gly4Ser)3 linker. B1 scFv comprising E-linker, L205, or LLB18 yielded comparable volumetric concentrations (3.2 g/L, 4.0 g/L and 3.8 g/L). B1 scFv comprising L218 yielded notably more (8.9 g/L). None of the four linkers led to increased intracellular B1 scFv solubility. A further aim of this study was to evaluate the feasibility of intracellular expression of Fab fragments in E. coli Strain A. The individual chains of the heterodimeric A4 Fab served as model proteins. The light chain yielded 14.2 g/L and the heavy chain 11.7 g/L. Therefore, intracellular expression of the individual A4 Fab chains proved to be a promising expression strategy.