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Titelaufnahme

Titel
Directed evolution of Botrytis aclada laccase for application in biofuel cells / submitted by Johannes Führer
VerfasserFührer, Johannes
Betreuer / BetreuerinPeterbauer, Clemens Karl ; Kittl, Roman
Erschienen[2015]
UmfangV, 61 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Masterarb., 2015
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Botrytis aclada, Laccase, Bio-Brennstoffzelle, Gerichtete Evolution, Sättigungsmutagenese, High-Throughput-Screening
Schlagwörter (EN)Botrytis aclada, laccase, biofuel cell, directed evolution, site saturation mutagenesis, high-throughput screening
Schlagwörter (GND)Botrytis aclada / Laccase / Chloridion / Enzymaktivität
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-2118 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
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Directed evolution of Botrytis aclada laccase for application in biofuel cells [1.34 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Laccasen mit hohem Redoxpotential sind vielseitige Enzyme mit verschiedensten Anwendungsmöglichkeiten, wie die Verwendung in enzymbasierten Biobrennstoffzellen, die Strom für implantierbare Biosensoren zur Verfügung zu stellen. Jedoch limitiert der Mangel an katalytischer Aktivität bei pH 7.4, die Inhibierung durch die hohe Chloridkonzentration im Blut (140-150 mM) sowie die niedrige Expressionsrate deren Einsatzfähigkeit. Botrytis aclada, ein pflanzenpathogener Ascomycet, exprimiert eine chloridtolerante Laccase mit hohem Redoxpotential, die als ein vielversprechender Kandidat für die Enzymoptimierung, mit dem Ziel, Aktivität sowie Stabilität bei physiolgischen Bedingungen zu verbessern, gilt. Ziel dieser Arbeit ist es, Mutationen zu finden, die das Verhalten dieser Laccase beeinflussen und damit den Zusammenbruch der Aktivität bei neutralen Bedingungen, den man bei derartigen Laccasen beobachtet, zu erklären. Zwei verschiedene Experimente, die entweder eine semi-rationale oder eine auf Zufall basierende Herangehensweise repräsentieren wurden hierfür durchgeführt. Für den semi-rationalen site-saturation Mutagenese Ansatz wurde eine Bibliothek basierend auf Mutationen, die während der gerichteten Evolution einer Laccase vom Basidiomyceten PM1 gefunden wurden, verwendet. Die Enzymbibliothek, des auf Zufall beruhenden “directed evolution” Ansatzes basierte auf einer thermostabilen B. aclada Laccase Variante, die zuvor entdeckt und in dieser Arbeit charakterisiert wurde. Beide Bibliotheken wurden mittels eines effizienten zweistufigen Screenings, untersucht. Im “site-saturation” Experiment wurde eine Variante, die eine große substratspezifische Veränderung im pH-Profil aufweist, entdeckt und charakterisiert. Das “directed evolution” Experiment ergab eine Variante mit deutlich verändertem pH-Profil. Diese Varianten beweisen die Viabilität dieses “enzyme engineering” Prozesses für dieses Protein und ermutigen so zu weiterer Forschung auf diesem Gebiet.

Zusammenfassung (Englisch)

High redox potential laccases are versatile enzymes with several potential applications such as the use in enzymatic biofuel cells for supplying implantable bio devices with power. However, poor catalytic activity at pH 7.4, strong inhibition by chloride concentrations found in blood (140-150 mM) and the generally low expression levels limit their applicability. Botrytis aclada, a plant pathogenic ascomycete, expresses a chloride tolerant high-redox potential laccase, which is a promising subject for enzyme engineering with the target to improve the catalytic activity and stability at physiological conditions. The goal of this study is to identify amino acid residues influencing the behaviour of this particular laccase and explain the breakdown of catalytic activity at neutral pH observable in this type of laccases. For this purpose two different experiments, representing either a semi-rational or a random enzyme engineering approach, were carried out. A library using the semi-rational site-saturation mutagenesis method was created based on mutations found during the directed evolution process of a laccase from the basidiomycete PM1. The random directed evolution library was based upon a thermostable B. aclada laccase variant that has been found earlier and was characterized during this work. Both libraries were analyzed with a two-step high-throughput screening which uses the yeast Pichia pastoris as expression host. In the site-saturation experiment a variant showing a large substrate specific shift in the pH-profile was discovered and characterized. The directed evolution experiment yielded a variant with a significantly modified pH profile. These variants prove the viability of the chosen enzyme engineering approach and simultaneously encourage further research in this field.