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Titelaufnahme

Titel
Bacterial artificial chromosome (BAC) based vs. conventional plasmid transfection : a comparison study in CHO cells / submitted by Bernhard Prewein
VerfasserPrewein, Bernhard
Betreuer / BetreuerinKunert, Renate
Erschienen2012
UmfangXIII, 98 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Univ. für Bodenkultur, Masterarb., 2012
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)künstliches Bakterienchromosom, BAC, CHO, scFc, scFv-Fc, Transfektionsvektoren, Transfektion, Antikörper, rekombinant
Schlagwörter (EN)Bacterial Artificial Chromosome, BAC, CHO, scFc, scFv-Fc, transfection, transfection method, vector, antibody, recombinant
Schlagwörter (GND)Künstliches Bakterienchromosom / CHO-Zelle
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-1449 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
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Bacterial artificial chromosome (BAC) based vs. conventional plasmid transfection [2.3 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Der Markt und die Anwendungsgebiete für therapeutische Proteine, wie unter anderem monoklonale Antikörper, sind durch starkes Wachstum geprägt. Deshalb gewinnen stabile Produktionssysteme und hohe Ausbeuten an Bedeutung. CHO Zellen sind für die Expression von rekombinanten Proteinen weit verbreitet und es gibt eine Vielzahl an Techniken, um eine Produktionszelllinie zu generieren. Weit verbreitet ist die konventionelle Plasmidtransfektion, doch um hiermit einen guten Produzenten zu etablieren, benötigt man Genamplifikation und zeitintensive Scree-ning-Runden. Eine alternative Methode ist die Verwendung von BACs als Transfektionsvektoren welche hohe Zellproduktivitäten auch ohne Genamplifikation erzielen können. Dies liegt daran, dass BACs höher transkribierte, so genannte offene Chromatinregionen mitbringen. Für diese Arbeit wurden zwei scFc Antikörper, 3D6scFc und 2F5scFc, in CHO Zellen exprimiert. Hierzu wurden Zelllinien mit konventioneller Plasmidtransfektion generiert und mit BAC-transfizierten Zellen verglichen. Dabei wurde kontinuierlich das Wachstum und die Produktivität eruiert. Zusätzlich wurden qPCR Analysen durchgeführt um die Zelllinien bezüglich Gen-Kopienzahlen und Transkriptmengen beurteilen zu können. Die intrazelluläre Produktkonzentration wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die spezifischen Produktivitäten waren in BAC-Transfektanten drei- bis vierfach höher als in den Plasmidtransfektanten ohne Genamplifikation. Die Gen-Kopienzahlen und intrazellulären Produktkonzentrationen waren zum Teil höher, doch besonders deutlich war ein Anstieg der Transkriptmenge in BAC-Transfektanten festzustellen. Insgesamt hat sich die Transfektion mittels BAC-Vektoren als eine vergleichsmäßig gute Methode zur Generierung von stabilen, hoch produzierenden CHO Zelllinien herausgestellt.

Zusammenfassung (Englisch)

The market and fields of application for therapeutic proteins, such as monoclonal antibodies, are constantly growing. Therefore, stable production systems and high yields become increasingly important. CHO cells are widely used for expressing recombinant proteins and there are several techniques available for generating a pro-ducing cell line. Conventional plasmid transfection is a common method, but for establishing a high producer cell line, gene amplification and time-consuming screen-ings are necessary. An alternative method is the application of BACs as transfection vectors, which generates high producing cell lines without the need for gene amplification. The BAC itself mediates this as it provides a highly transcribed open chromatin region. For this work, two scFc antibodies, 3D6scFc and 2F5scFc, were expressed in CHO cells. Cell lines were established using conventional plasmid transfection and compared to BAC transfectants. Therefore, growth and productivity were continuously monitored. Additionally, qPCR was performed to compare the cell lines regarding gene copy numbers and transcript level. Additionally, intracellular product concentration was determined by flow cytometry. Specific productivities were three to four times higher for BAC transfectants compared to plasmid transfection without amplification. Gene copy numbers and intracellular product concentration were partly higher but transcript levels were significantly increased for BAC transfectants. Thus, BAC transfection demonstrated to be a superior method for establishing stable, high producing CHO cell lines.