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Titelaufnahme

Titel
Influence of the endoribonuclease MazF on cellular growth and recombinant protein production in Escherichia coli / eingereicht von Csilla Török
VerfasserTörök, Csilla
GutachterBayer, Karl
Erschienen2010
UmfangIII, 76 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien., Univ. für Bodenkultur, Masterarb., 2010
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (DE)Escherichia coli Rekombinante Proteinproduktion Wachstumsentkopplung MazF Ruhezustand
Schlagwörter (EN)Escherichia coli Recombinant Proteinproduction Non Growth Associated MazF Dormant state
Schlagwörter (GND)Escherichia coli / Zellwachstum / Ribonucleasen
URNurn:nbn:at:at-ubbw:1-696 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
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Influence of the endoribonuclease MazF on cellular growth and recombinant protein production in Escherichia coli [0.62 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die Expression rekombinanter Proteine mit Escherichia coli basierten Wirts/Vektorsystemen erfolgt in der Regel wachstumsassoziiert, d.h. die Produktbildung erfolgt parallel zur Synthese zellulärer Proteine. Die Entwicklung von Genkonstrukten mit wachstumsentkoppelter Produktbildung sollte daher eine Steigerung der Produktausbeute durch erhöhte Verfügbarkeit metabolischer Ressourcen ermöglichen. Mit Hilfe der Endoribonuklease MazF aus E. coli ist es möglich das Zellwachstum zu inhibieren und gleichzeitig rekombinante Proteine, die von ACA freier mRNA translatiert werden, spezifisch anzureichern. Ziel dieser Arbeit war die Herstellung eines auf MazF basierten E. coli Expressionsstammes für den industriellen Einsatz. Aufgrund kontroversieller Befunde über den Einfluss von MazF auf den Wirtszellmetabolismus wurde untersucht inwieweit die Stoffwechselaktivität und damit die Synthese des rekombinanten Proteins unter MazF Expressionsbedingungen aufrecht erhalten werden kann. Dazu wurde E. coli HMS174(DE3)pBAD33_mazF in Schüttelkolben und im Bioreaktor im induzierten und nicht-induzierten Zustand kultiviert. Die Expression von MazF führte zu Wachstumsinhibierung jedoch ohne negative Auswirkung auf die Viabilität. Die Zellen befanden sich in einem reversiblen Ruhezustand und Zellwachstum konnte nach Aufhebung der mazF Expression wieder angeregt werden. Für die Konstruktion des Produktionsstammes wurde das Gen der humanen Superoxid Dismutase (hSOD) ACA frei synthetisiert und in einen Expressionsvektor integriert. Die nachfolgende Expression des Zielproteins war allerdings aufgrund einer im nicht kodierenden Bereich vorhandenen ACA Sequenz zwischen RBS und MCS vollständig inhibiert. Nach Austausch dieses Genabschnittes kann das entwickelte Plasmid pET30aSOD_ACAfree in den Wirtsstamm transformiert und für die Konstruktion eines zweiplasmidigen Produktionsstammes zur wachstumsentkoppelten Produktion rekombinanter Proteine verwendet werden.

Zusammenfassung (Englisch)

The expression of recombinant proteins using Escherichia coli is state of the art technology. Due to growth associated product formation kinetics recombinant proteins are synthesized in parallel to cellular proteins. Therefore, a further increase of recombinant protein production should be achieved by development of gene constructs for product formation in a non growth associated manner. Thereby maximal resources can be directed to recombinant protein synthesis. Moreover, the production of toxic proteins can be enabled. By utilizing the endoribonuclease MazF of E. coli which is able to inhibit cell growth, recombinant proteins derived from ACA free mRNA can be accumulated in high amounts in a so called single protein production system. The goal of this diploma thesis was to create a MazF based E. coli expression strain suitable for application on industrial scale. Due to controversial findings published in literature the impact of MazF on host cell metabolism had to be investigated. Therefore MazF was overexpressed in E. coli HMS174(DE3)pBAD33_mazF in shake flask and bioreactor cultivations. The impact of MazF on cell growth was monitored by optical density and cellular dry weight, the influence on cell viability by flow cytometry. The expression level of a target protein was analysed by SDS-PAGE electrophoreses. Expression of MazF in exponentially growing E. coli cells led to reduced or completely inhibited cell growth without negative impact on cell viability. Cells were in a reversible "quasi dormant" state and cell growth could be fully restored subsequent to termination of the mazF expression. For the construction of a production strain, the gene encoding for the model protein human superoxide dismutase (hSOD) was synthesized to be devoid of the triplet ACA and incorporated into an appropriate expression vector. However, protein expression of a target protein susceptible for MazF was completely inhibited due a single ACA sequence in the non-coding part between RBS and MCS. After modification of the disruptive ACA sequence between the RBS and the MCS site the vector pET30aSOD_ACAfree can be integrated into the expression host and thereafter used for construction of a two plasmid